【摘要】：研究背景目前,原發(fā)性肺癌已成為我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。骨轉(zhuǎn)移是晚期肺癌主要的血行轉(zhuǎn)移部位之一。晚期肺癌患者中有30%~40%出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移,而出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移后患者的中位生存時間僅有6-10個月,五年生存率不足5%。Micro RNA(mi RNA)是一類內(nèi)源性的、非編碼的小RNA,其長度約為22nt。Mi RNA對細胞的增殖、分化、發(fā)育、凋亡等生物學行為有著重要的調(diào)控作用。Mi RNA是通過特異性結(jié)合目的m RNA的3’-untranslated region(3’UTR區(qū))行使其調(diào)控功能,繼而抑制目的基因的表達。Mi RNA可通過兩條途徑來完成對目的基因的抑制:一是m RNA水平剪切,二是翻譯水平抑制。Mi RNA同樣受轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。Let7a-2是let7家族的一員,該家族具有高度保守的序列,行使相似的功能。Let7普遍表達于成人組織中,但是在腫瘤組織,特別是肺癌組織中低表達。然而目前尚未有研究能明確解釋腫瘤細胞中mi RNA let7下調(diào)的原因。T Brachyury轉(zhuǎn)錄因子最初被發(fā)現(xiàn)在胚胎脊索中特異性表達,而正常人體組織表達陰性。近些年國內(nèi)外許多學者發(fā)現(xiàn)Brachyury在多種腫瘤細胞,如肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、口腔鱗狀細胞癌的組織中異常高表達。Brachyury作為一種轉(zhuǎn)錄因子,參與腫瘤細胞多種惡性生物學行為,如腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化、侵襲等。在多種癌癥中,Brachyury的高表達與癌癥患者的不良預后密切相關。研究目的探討T Brachyury轉(zhuǎn)錄因子與mi RNA let7在肺癌中的調(diào)控關系和分子機制,并進一步研究兩者對肺癌細胞生物學行為的影響,從新的角度闡明肺癌惡性生物學行為的發(fā)生機制,為Brachyury陽性表達腫瘤患者尋找新的抗腫瘤治療方向奠定理論基礎。研究方法1.通過建立Brachyury過表達細胞并采用基因微陣列(microarray)技術(shù)檢測差異表達的mi RNA;2.通過網(wǎng)上公共數(shù)據(jù)庫,采用生物信息學分析方法分析肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、浸潤性乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、腎透明細胞癌、膀胱移行細胞癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌中Brachyury與let7a-2的表達相關性;3.選擇多個腫瘤細胞系進行Brachyury過表達或干擾,采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)檢測let7表達水平的變化;4.選擇多個腫瘤細胞系進行l(wèi)et7a-2的過表達或干擾,采用Real-time PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)技術(shù)檢測Brachyury蛋白表達水平的變化;5.采用免疫組織化學染色技術(shù)檢測肺癌骨轉(zhuǎn)移標本中Brachyury的表達水平,采用micro RNA原位雜交組織化學技術(shù)檢測肺癌骨轉(zhuǎn)移標本中l(wèi)et7a2的表達水平,研究兩者的表達相關性;6.采用熒光素酶報告系統(tǒng)(p GL4.1和p RL-CMV)和基因突變技術(shù)明確Brachyury對let7a-2的調(diào)控作用及具體調(diào)控位點;7.采用熒光素酶報告系統(tǒng)(p MIR和p RL-CMV)和基因突變技術(shù)明確let7a-2對Brachyury的調(diào)控作用及具體調(diào)控位點;8.在肺癌細胞系H460細胞中干擾Brachyury以及抑制let7a-2的表達,研究let7a-2下游基因表達變化;9.在肺癌細胞系H460細胞中干擾Brachyury以及抑制let7a-2的表達,研究上皮間質(zhì)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關基因表達變化;10.在肺癌細胞系H460細胞中干擾Brachyury以及抑制let7a-2的表達,研究對肺癌細胞增殖、遷徙和侵襲能力的影響。結(jié)果1.Brachyury過表達的肺癌細胞系H1299細胞中l(wèi)et7a-2的表達量出現(xiàn)下調(diào);2.采用生物信息學分析研究發(fā)現(xiàn),在肺腺癌和肺鱗狀細胞癌中Brachyury與let7a-2表達量呈負相關;在浸潤性乳腺癌中Brachyury與let7a-2表達量呈正相關;在頭頸部鱗狀細胞癌、腎透明細胞癌、膀胱移行細胞癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌中Brachyury與let7a-2表達量無相關性;3.Brachyury表達陽性的人肺癌細胞系H460、人黑色素瘤細胞系SK-MEL-28、人肝癌細胞系7402進行Brachyury Si RNA干擾,發(fā)現(xiàn)let7a-2表達量上調(diào);對Brachyury表達陰性的人肺癌細胞系H1299、人前列腺癌細胞系PC-3、人腎上皮細胞293T進行Brachyury過表達,發(fā)現(xiàn)let7a-2表達量下調(diào);4.對Brachyury表達陽性的人肺癌細胞系H460、人黑色素瘤細胞系SK-MEL-28、人肝癌細胞系7402進行l(wèi)et7a-2過表達,發(fā)現(xiàn)Brachyury蛋白表達量下調(diào);對Brachyury表達陰性的人肺癌細胞系H1299、人前列腺癌細胞系PC-3、人腎上皮細胞293T進行l(wèi)et7a-2干擾,發(fā)現(xiàn)Brachyury蛋白表達量上調(diào);5.在肺癌骨轉(zhuǎn)移組織標本中,Brachyury與let7a-2的表達量呈負相關性;6.Brachyury可直接結(jié)合至let7a-2啟動子區(qū)-1343~-1329bp區(qū)域,抑制let7a-2的表達;7.Let7a-2可與Brachyury的3’UTR區(qū)的特異性序列產(chǎn)生互補配對,從而抑制Brachyury的表達;8.在H460細胞中干擾Brachyury后,NRAS和Cyclin D2的表達水平出現(xiàn)下調(diào),在此基礎上再抑制let7a-2后,NRAS和Cyclin D2的表達水平下調(diào);9.在H460細胞中干擾Brachyury后,E-cadherin的表達水平出現(xiàn)上調(diào),在此基礎上再抑制let7a-2后,E-cadherin的表達水平部分恢復;10.Brachyury—let7a-2負反饋環(huán)路可促進肺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力。結(jié)論1.在多種腫瘤細胞,特別是肺癌中,T Brachyury轉(zhuǎn)錄因子與micro RNA let7a-2存在負相關性;2.T Brachyury轉(zhuǎn)錄因子與micro RNA let7a-2存在相互的負性調(diào)控關系;3.Brachyury—let7a-2負反饋環(huán)路可正性調(diào)控NRAS和Cyclin D2、負性調(diào)控E-cadherin;4.Brachyury—let7a-2負反饋環(huán)路可促進肺癌細胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移能力。
【圖文】：

芯片雜交掃描圖

差異miRNA的非監(jiān)督層次聚類
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：2574629