【摘要】：研究背景目前,原發(fā)性肺癌已成為我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。骨轉(zhuǎn)移是晚期肺癌主要的血行轉(zhuǎn)移部位之一。晚期肺癌患者中有30%~40%出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移,而出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移后患者的中位生存時(shí)間僅有6-10個(gè)月,五年生存率不足5%。Micro RNA(mi RNA)是一類內(nèi)源性的、非編碼的小RNA,其長(zhǎng)度約為22nt。Mi RNA對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育、凋亡等生物學(xué)行為有著重要的調(diào)控作用。Mi RNA是通過(guò)特異性結(jié)合目的m RNA的3’-untranslated region(3’UTR區(qū))行使其調(diào)控功能,繼而抑制目的基因的表達(dá)。Mi RNA可通過(guò)兩條途徑來(lái)完成對(duì)目的基因的抑制:一是m RNA水平剪切,二是翻譯水平抑制。Mi RNA同樣受轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。Let7a-2是let7家族的一員,該家族具有高度保守的序列,行使相似的功能。Let7普遍表達(dá)于成人組織中,但是在腫瘤組織,特別是肺癌組織中低表達(dá)。然而目前尚未有研究能明確解釋腫瘤細(xì)胞中mi RNA let7下調(diào)的原因。T Brachyury轉(zhuǎn)錄因子最初被發(fā)現(xiàn)在胚胎脊索中特異性表達(dá),而正常人體組織表達(dá)陰性。近些年國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)Brachyury在多種腫瘤細(xì)胞,如肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌的組織中異常高表達(dá)。Brachyury作為一種轉(zhuǎn)錄因子,參與腫瘤細(xì)胞多種惡性生物學(xué)行為,如腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、侵襲等。在多種癌癥中,Brachyury的高表達(dá)與癌癥患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。研究目的探討T Brachyury轉(zhuǎn)錄因子與mi RNA let7在肺癌中的調(diào)控關(guān)系和分子機(jī)制,并進(jìn)一步研究?jī)烧邔?duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,從新的角度闡明肺癌惡性生物學(xué)行為的發(fā)生機(jī)制,為Brachyury陽(yáng)性表達(dá)腫瘤患者尋找新的抗腫瘤治療方向奠定理論基礎(chǔ)。研究方法1.通過(guò)建立Brachyury過(guò)表達(dá)細(xì)胞并采用基因微陣列(microarray)技術(shù)檢測(cè)差異表達(dá)的mi RNA;2.通過(guò)網(wǎng)上公共數(shù)據(jù)庫(kù),采用生物信息學(xué)分析方法分析肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、浸潤(rùn)性乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、膀胱移行細(xì)胞癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌中Brachyury與let7a-2的表達(dá)相關(guān)性;3.選擇多個(gè)腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行Brachyury過(guò)表達(dá)或干擾,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)檢測(cè)let7表達(dá)水平的變化;4.選擇多個(gè)腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行l(wèi)et7a-2的過(guò)表達(dá)或干擾,采用Real-time PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)技術(shù)檢測(cè)Brachyury蛋白表達(dá)水平的變化;5.采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)肺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本中Brachyury的表達(dá)水平,采用micro RNA原位雜交組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)肺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本中l(wèi)et7a2的表達(dá)水平,研究?jī)烧叩谋磉_(dá)相關(guān)性;6.采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(p GL4.1和p RL-CMV)和基因突變技術(shù)明確Brachyury對(duì)let7a-2的調(diào)控作用及具體調(diào)控位點(diǎn);7.采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(p MIR和p RL-CMV)和基因突變技術(shù)明確let7a-2對(duì)Brachyury的調(diào)控作用及具體調(diào)控位點(diǎn);8.在肺癌細(xì)胞系H460細(xì)胞中干擾Brachyury以及抑制let7a-2的表達(dá),研究let7a-2下游基因表達(dá)變化;9.在肺癌細(xì)胞系H460細(xì)胞中干擾Brachyury以及抑制let7a-2的表達(dá),研究上皮間質(zhì)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)基因表達(dá)變化;10.在肺癌細(xì)胞系H460細(xì)胞中干擾Brachyury以及抑制let7a-2的表達(dá),研究對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷徙和侵襲能力的影響。結(jié)果1.Brachyury過(guò)表達(dá)的肺癌細(xì)胞系H1299細(xì)胞中l(wèi)et7a-2的表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào);2.采用生物信息學(xué)分析研究發(fā)現(xiàn),在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中Brachyury與let7a-2表達(dá)量呈負(fù)相關(guān);在浸潤(rùn)性乳腺癌中Brachyury與let7a-2表達(dá)量呈正相關(guān);在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、膀胱移行細(xì)胞癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌中Brachyury與let7a-2表達(dá)量無(wú)相關(guān)性;3.Brachyury表達(dá)陽(yáng)性的人肺癌細(xì)胞系H460、人黑色素瘤細(xì)胞系SK-MEL-28、人肝癌細(xì)胞系7402進(jìn)行Brachyury Si RNA干擾,發(fā)現(xiàn)let7a-2表達(dá)量上調(diào);對(duì)Brachyury表達(dá)陰性的人肺癌細(xì)胞系H1299、人前列腺癌細(xì)胞系PC-3、人腎上皮細(xì)胞293T進(jìn)行Brachyury過(guò)表達(dá),發(fā)現(xiàn)let7a-2表達(dá)量下調(diào);4.對(duì)Brachyury表達(dá)陽(yáng)性的人肺癌細(xì)胞系H460、人黑色素瘤細(xì)胞系SK-MEL-28、人肝癌細(xì)胞系7402進(jìn)行l(wèi)et7a-2過(guò)表達(dá),發(fā)現(xiàn)Brachyury蛋白表達(dá)量下調(diào);對(duì)Brachyury表達(dá)陰性的人肺癌細(xì)胞系H1299、人前列腺癌細(xì)胞系PC-3、人腎上皮細(xì)胞293T進(jìn)行l(wèi)et7a-2干擾,發(fā)現(xiàn)Brachyury蛋白表達(dá)量上調(diào);5.在肺癌骨轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本中,Brachyury與let7a-2的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)性;6.Brachyury可直接結(jié)合至let7a-2啟動(dòng)子區(qū)-1343~-1329bp區(qū)域,抑制let7a-2的表達(dá);7.Let7a-2可與Brachyury的3’UTR區(qū)的特異性序列產(chǎn)生互補(bǔ)配對(duì),從而抑制Brachyury的表達(dá);8.在H460細(xì)胞中干擾Brachyury后,NRAS和Cyclin D2的表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào),在此基礎(chǔ)上再抑制let7a-2后,NRAS和Cyclin D2的表達(dá)水平下調(diào);9.在H460細(xì)胞中干擾Brachyury后,E-cadherin的表達(dá)水平出現(xiàn)上調(diào),在此基礎(chǔ)上再抑制let7a-2后,E-cadherin的表達(dá)水平部分恢復(fù);10.Brachyury—let7a-2負(fù)反饋環(huán)路可促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。結(jié)論1.在多種腫瘤細(xì)胞,特別是肺癌中,T Brachyury轉(zhuǎn)錄因子與micro RNA let7a-2存在負(fù)相關(guān)性;2.T Brachyury轉(zhuǎn)錄因子與micro RNA let7a-2存在相互的負(fù)性調(diào)控關(guān)系;3.Brachyury—let7a-2負(fù)反饋環(huán)路可正性調(diào)控NRAS和Cyclin D2、負(fù)性調(diào)控E-cadherin;4.Brachyury—let7a-2負(fù)反饋環(huán)路可促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移能力。
【圖文】：

芯片雜交掃描圖

差異miRNA的非監(jiān)督層次聚類
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2574629