【摘要】：研究背景NOTCH信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡,在機(jī)體發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。越來越多的研究表明:Notch信號(hào)通路在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中扮演重要角色,但其發(fā)揮致癌或抑癌作用通常依賴于所處的細(xì)胞環(huán)境。口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)是最常見的人類惡性腫瘤之一,約占頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma,HNSCC)的90%以上,其致病機(jī)理還不清楚。最新完成的HNSCC大型隊(duì)列的全基因組研究表明人Notch1基因發(fā)生高頻突變,提示Notch1基因與OSCC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。番荔枝內(nèi)酯(Annonaceous acetogenins,ACGs)是從番荔枝科植物中提取的一類長(zhǎng)鏈脂肪酸內(nèi)酯化合物,對(duì)人白血病細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞等有很強(qiáng)的抑制作用,具有強(qiáng)效抗腫瘤活性和能逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等特性,使其成為國內(nèi)外抗腫瘤藥研究熱點(diǎn)。但其對(duì)OSCC的作用和分子機(jī)制仍不明確。研究目的1.分析人Notch1基因在OSCC組織樣本和細(xì)胞中的基因變異和表達(dá)差異。2.探討ACGs對(duì)OSCC細(xì)胞的增殖、凋亡的影響及這些影響是否通過Notch1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn);在此基礎(chǔ)上,上調(diào)或下調(diào)Notch1信號(hào)后,分析ACGs對(duì)OSCC細(xì)胞增值的影響,為OSCC防治提供研究基礎(chǔ)。研究方法1.通過TCGA和USCS數(shù)據(jù)庫分析人Notch1基因在OSCC中的突變、表達(dá)差異和5年病人生存率。2.從5例OSCC及其癌旁組織中提取RNA,用qRT-PCR檢測(cè)人Notch1基因的表達(dá)水平;通過17例OSCC及其癌旁組織的石蠟切片完成免疫組化,分析Notch1基因的表達(dá)差異。分別提取正常口腔上皮細(xì)胞和OSCC細(xì)胞的RNA和蛋白,qRT-PCR及Western blot檢測(cè)上述兩類細(xì)胞系中Notch1及其相關(guān)蛋白的表達(dá)。3.通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ACGs對(duì)OSCC細(xì)胞增殖的影響,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)ACGs對(duì)OSCC細(xì)胞凋亡的影響,同時(shí)分析ACGs作用OSCC細(xì)胞后Notch1蛋白及其轉(zhuǎn)錄因子RBP-Jκ和下游目標(biāo)蛋白Hes1的表達(dá)。4.采用過表達(dá)Notch1胞內(nèi)段(N1ICD)和DAPT抑制Notch1信號(hào)通路,進(jìn)一步驗(yàn)證ACGs通過Notch1信號(hào)通路影響OSCC細(xì)胞的增殖。研究結(jié)果1.TCGA和USCS數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示:人Notch1基因在HNSCC突變率高達(dá)20%,生存分析結(jié)果顯示Notch1表達(dá)較高的病人5年生存期較長(zhǎng),值得關(guān)注的是大部分病人的癌組織中RBP-Jκ的表達(dá)高于癌旁組織。2.qRT-PCR結(jié)果表明:在5例OSCC病人中3個(gè)病人Notch1表達(dá)水平高于其配對(duì)的癌旁組織;免疫組化結(jié)果表明:17例OSCC切片中有11例病人癌組織的Notch1呈陽性,且其中部分病人癌組織分裂期細(xì)胞染色較深,顯示強(qiáng)陽性結(jié)果;qRT-PCR及Western blot結(jié)果也顯示3種OSCC細(xì)胞系中Notch1的表達(dá)均高于正�？谇簧掀ぜ�(xì)胞NOK。3.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ACGs對(duì)OSCC細(xì)胞系SCC15和SCC25增殖的影響,結(jié)果表明:ACGs對(duì)SCC15和SCC25的增殖均有抑制作用,且隨著ACGs劑量的升高,細(xì)胞凋亡數(shù)也增加,呈劑量依賴性。4.通過Annexin V-FITC/PI染色和流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)ACGs誘導(dǎo)SCC15和SCC25細(xì)胞發(fā)生凋亡,特別是發(fā)現(xiàn)SCC15發(fā)生晚期凋亡。5.Western blot 結(jié)果表明:在 ACGs 作用下,SCC15 細(xì)胞中 Notch1、RBP-Jκ和Hes1的表達(dá)均隨著劑量增加而減少,具有劑量依賴性。6.成功構(gòu)建Notch1胞內(nèi)段N1ICD真核表達(dá)質(zhì)粒并在SCC15細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。同未轉(zhuǎn)染N1ICD的SCC15細(xì)胞相比,在ACGs作用下,過表達(dá)N1ICD的SCC15細(xì)胞的增殖明顯;同未轉(zhuǎn)染N1ICD的SCC15細(xì)胞相比,在ACGs和DAPT的共同作用下,過表達(dá)N1ICD的SCC15細(xì)胞的增殖能力被明顯抑制。研究結(jié)論1.人Notch1基因在OSCC中是高頻突變基因,其表達(dá)水平同OSCC的5年生存時(shí)間有關(guān);進(jìn)一步研究顯示人Notch1基因在OSCC組織和細(xì)胞水平上有較高的表達(dá),表明人Notch1基因可能與OSCC的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。2.ACGs對(duì)OSCC細(xì)胞生長(zhǎng)增殖有抑制作用,能抑制OSCC細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死,ACGs作用于OSCC細(xì)胞后,Notch1及RBP-Jκ和Hes1的表達(dá)下降。上調(diào)和抑制Notch1信號(hào)水平影響ACGs對(duì)OSCC增殖抑制。
【圖文】：

１．３．５免疫組化檢測(cè)ＯＳＣＣ腫瘤樣本中Ｎｏｔｃｈｌ的表達(dá)逡逑在完成的１７對(duì)樣本中，有１１對(duì)樣本癌組織相對(duì)于癌旁組織呈Ｎｏｔｃｈｌ陽性。逡逑圖１－５中可以看出，在癌組織中Ｎｏｔｃｈｌ表達(dá)明顯高于癌旁組織，且箭頭標(biāo)注的逡逑有絲分裂期細(xì)胞表現(xiàn)為強(qiáng)陽性。上述結(jié)果表明Ｎｏｔｃｈｌ在大部分ＯＳＣＣ組織中高逡逑表達(dá)，且在有絲分裂時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ｎｏｔｃｈｌ基因表達(dá)水平最高，提示在ＯＳＣＣ中，逡逑Ｎｏｔｃｈｌ與細(xì)胞的增殖分裂密切相關(guān)，，在腫瘤生長(zhǎng)中起重要作用。逡逑？、？邋？？邐欲腿…＼．，ｒ逡逑Ａ邐Ｂ逡逑ｆ邋．邐－令Ｗ邋＇邋Ａ邐？邋＇邋＊、逡逑？邋．，邐心？？二？逡逑

本文編號(hào)：2572587