【摘要】：本研究旨在探討不同的取代基對全新合成的菌綠素光敏劑的抗腫瘤活性的影響。本研究分為兩部分:第一部分主要運用定量構(gòu)效關(guān)系探討具有不同取代基12種菌綠素化合物的化合物結(jié)構(gòu)與光動力治療(Photodynamic therapy,PDT)殺傷腫瘤細胞效果的聯(lián)系。不同極性的取代基對菌綠素光敏劑PDT殺傷腫瘤細胞的效果和亞細胞定位的具有不同的影響,為新型菌綠素光敏劑的開發(fā)提供重要線索。第二部分主要探討二氰基取代基、不同的中心金屬離子以及藥物傳遞系統(tǒng)對合成菌綠素在體內(nèi)和體外的PDT作用效果的影響。二氰基取代基增強了菌綠素作為光敏劑活性和光穩(wěn)定性,而聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)膠束被用作藥物遞送系統(tǒng),可以光敏劑減少聚集和增加PDT活性。第一部分:菌綠素PDT效果的定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)的研究。本研究是第一次將定量構(gòu)效關(guān)系應(yīng)用于合成的菌綠素光敏劑的活性研究。第一章研究了12種新合成光敏劑的吸收光譜、極性、細胞攝取量與細胞殺傷效果的定量構(gòu)效關(guān)系,并用激光共聚焦顯微鏡觀察菌綠素光敏劑在宮頸癌細胞Hela中的亞細胞定位情況。1.用紫外分光光度法測定菌綠素BC1-12的吸收光譜,結(jié)果表明菌綠素的吸收峰在730-780 nm之間。2.通過在攪拌法實驗獲得12種光敏劑在辛醇與水的分配系數(shù)(m Log P)值,在菌綠素結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上通過軟件計算出理論分配系數(shù)(clog P值)。測得的分配系數(shù)(m Log P)值是-0.5-2.5之間。結(jié)果表明,12個菌綠素極性是具有多樣性的,包括親脂性(3個化合物),兩親性(4個化合物)和極性(5個化合物)。3.用熒光分光光度法測定菌綠素BC1-12在人宮頸癌細胞Hela中的吸收量。結(jié)果表明在給藥濃度為20μM時,Hela細胞對菌綠素BC1-12的藥物吸收量均在0.1-0.4μM/L 104 cells范圍內(nèi)。4.用MTT法檢測化合物BC1-12對腫瘤細胞的PDT殺傷作用,而在光照條件下10J/cm2對體外培養(yǎng)的宮頸癌Hela細胞的半數(shù)致死量LD50來衡量PDT的殺細胞活性。結(jié)果表明化合物BC1-12在0.25-1μM劑量范圍內(nèi)的暗毒性較小。最活躍的化合物具有100n M或更低的LD50值(BC3,12,4,6,2)。具有中間活動的化合物具有100n M至1μM的之間的LD50值(BC11,1,10,9)�；钚暂^低的化合物LD 50值大于1μM(BC5,7,8)。5.用激光共聚焦顯微鏡觀察三種不同不同結(jié)構(gòu)特征及不同Log P值的菌綠素(BC4,6,8)在Hela人宮頸癌細胞中的定位情況。結(jié)果顯示親脂性較高的BC4定位于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體,中度親脂性BC6主要主要定位在溶酶體,和低親脂性的BC8主要定位于溶酶體。6.建立數(shù)學模型,采用理論脂水分布系數(shù)(c Log P)和測量脂水分布系數(shù)m Log P作為結(jié)構(gòu)參數(shù),采用每單位攝入半數(shù)致死量LD50作為PDT活性參數(shù)作為PDT活性參數(shù),推算菌綠素結(jié)構(gòu)與PDT活性的定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR),得到PDT細胞毒性與測量脂水分布系數(shù)m Log P相關(guān)性(R2=0.94)顯著高于比理論脂水分布系數(shù)c Log P相關(guān)性(R2=0.61)。結(jié)論:定量構(gòu)效關(guān)系的結(jié)果表明光敏劑取代基的極性與光敏劑的殺細胞效果具有高度相關(guān)性,兩親性的菌綠素光敏劑具有最大的光動力活性,可能是由于兩親性菌綠素光敏劑更傾向于在膜脂質(zhì)雙層含量高的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位。在這些關(guān)鍵細胞器中產(chǎn)生PDT作用誘導的損傷是最有可能觸發(fā)細胞死亡。第二部分(第二、三、四章):評價二氰基、中心金屬離子(氫、鋅、鈀)以及聚氧乙烯蓖麻油膠束介導的藥物轉(zhuǎn)遞系統(tǒng)對合成菌綠素的PDT活性的影響作用第二章首先研究四個新合成菌綠素母體菌綠素(BC)、二氰基菌綠素(NC)2BC、二氰基鋅菌綠素(NC)2BC-Zn和二氰基鈀菌綠素(NC)2BC-Pd的光化學特性,探討了二氰基以及金屬離子對菌綠素光敏劑光漂白和PDT活性的影響。第三章研究納米膠束藥物載體(Cremophor?EL,CREL)包封對于提高菌綠素光敏劑的水溶性和PDT活性的作用的影響,以及比較游離菌綠素和膠束封包菌綠素介導的PDT對人宮頸癌細胞的體外殺傷作用。第四章測試了活性最佳二氰基鈀菌綠素(NC)2BC-Pd的膠束制劑在異位人宮頸癌小鼠模型的抗腫瘤作用,對新型光敏劑的研發(fā)以及納米膠束藥物載體應(yīng)用于臨床提供實驗依據(jù)提供實驗依據(jù)。1.紫外可見分光光度法被用來研究比較4個新菌綠素光敏劑吸收光譜和自聚集現(xiàn)象。結(jié)果表明:所有4個新菌綠素化合物之間740 nm至765nm的吸收峰在近紅外范圍。4個新菌綠素在培養(yǎng)基中都產(chǎn)生了自聚集現(xiàn)象,帶金屬離子的(NC)2BC-Zn和(NC)2BC-Pd自聚集現(xiàn)象較低。2.紫外分光光度計測量菌綠素光敏劑的光譜,通過在不同光照劑量下光譜的峰值變化探討光敏劑的光穩(wěn)定性(光漂白)。結(jié)果表明,(NC)2BC和(NC)2BC-Pd比BC更穩(wěn)定,不易發(fā)生光漂白,二氰基和鈀金屬的添加增加了吡咯環(huán)的光穩(wěn)定性。3.使用單態(tài)氧和羥基自由基熒光探針測量活性氧的產(chǎn)量及類型,活性氧產(chǎn)量的順序為(NC)2BC-Pd(NC)2BC-Zn(NC)2BCBC。然而只有(NC)2BC-Pd和(NC)2BC發(fā)生I型光化學反應(yīng),產(chǎn)生了羥基自由基,激活羥基自由基熒光探針HPF。4.薄膜水合方法制備的Cremophor膠束藥物遞送系統(tǒng)。納米膠束的儲存濃度約為500μM。5.采用紫外可見光分光度計測量各個化合物的細胞攝取量。菌綠素BC和(NC)2BC-Pd具有最高細胞攝取量,其次是(NC)2BC和(NC)2BC-Zn。使用納米膠束封包技術(shù)降低了(NC)2BC-Pd和BC的攝取,但對(NC)2BC和(NC)2BC-Zn的攝取沒有明顯的影響。6.在10J/cm2的近紅外光照能量下,MTT測量各個菌綠素對于人宮頸癌細胞的PDT活性(根據(jù)半數(shù)致死量LD50值)。PDT活性最高的化合物是(NC)2BC-Pd,LD50值為25 n M。(NC)2BC的活性居中,LD50值為60n M,而其中最不活躍的化合物是BC和(NC)2BC-Zn,它們的LD50值≥1μM。膠束封包都顯著降低了光敏劑PDT作用的孵育時間,而且提高了4個光敏劑殺傷腫瘤細胞的PDT活性。活性較低BC的膠束封包制劑PDT活性提高了5倍,LD50濃度由1.8μM降至為350 n M。原本活性很強的(NC)2BC-Pd及(NC)2BC只顯示了不到3倍的改進。7.共聚焦顯微鏡來測定BC,(NC)2BC和(NC)2BC-Zn及其納米膠束制劑的亞細胞定位情況。標記溶酶體的吖啶橙和標記線粒體的羅丹明123被用來確定所造成的PDT與(NC)2BC鈀使用直接稀釋或納米膠束遞送的細胞內(nèi)損傷的位置。膠束作為藥物遞送系統(tǒng)可改變菌綠素光敏劑在亞細胞器的分布。8.嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)的BALB/c小鼠的人宮頸癌異種移植物模型來評價(NC)2BC-Pd-CREL介導的PDT療效。荷瘤小鼠接受(NC)2BCPd-CREL尾靜脈注射1毫克/千克體重的劑量。9.使用Hochest33342血管灌注染色研究PDT治療后1小時,腫瘤血管灌注變化情況。與對照相比,(NC)2BC-Pd-CREL介導的PDT導致腫瘤的血管灌注的顯著下降。10.荷瘤重度免疫缺陷小鼠尾靜脈給予(NC)2BC-Pd-CREL注射后進行PDT處理。結(jié)果表明PDT治療顯著抑制了移植瘤的生長。結(jié)論:取代基團二氰基提高了菌綠素光敏劑的光穩(wěn)定性以及光活性,中心金屬離子降低了光敏劑自聚集現(xiàn)象。金屬離子鈀的添加促使光化學反應(yīng)轉(zhuǎn)為I型光化學反應(yīng),PDT活性得到極大的提高。本研究還發(fā)現(xiàn)菌綠素的亞細胞定位情況影響菌綠素PDT活性,定位在線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的光敏劑具有更強的PDT活性。聚氧乙烯蓖麻油納米膠束載體的應(yīng)用不僅提高了光敏劑在水溶液中的溶解度,降低光敏劑自聚集現(xiàn)象,有效提高光敏劑的PDT活性。(NC)2BC-Pd-CREL介導的PDT治療在裸鼠宮頸癌異種移植瘤的增殖有明顯的抑制作用,PDT破壞腫瘤的血管灌注。
【圖文】：

卟啉，二氫卟酚和菌綠素的化學結(jié)構(gòu)和吸收圖譜

2.3.1 二氰基菌綠素的光譜菌綠素溶于甲醇的光譜顯示，4 個菌綠素在近紅外波段 730-760 nm 都較高的吸收峰。結(jié)果表明，中心重原子金屬的插入后，，由于增強了菌綠素環(huán)的平面性，從而使菌綠素的 B 帶和 Q 帶吸收有所增加，熒光量子產(chǎn)率很大的提高，又由于金屬原子產(chǎn)生的重原子效應(yīng)使得菌綠素熒光壽命變短從而導致輻射躍遷幾率大大提高；吸電子取代基二氰基的添加，進一步抑了菌綠素環(huán)中 π 電子的離域。取代基二氰基也增加了分子的共面性，使得光量子產(chǎn)率略有增加，熒光壽命變長。中心插入金屬原子和周邊取代基二基均減小了菌綠素環(huán)電子密度，導致 HOMO 與 LUMO 之間的能量差升高從而使熒光峰藍移。進一步的超快瞬態(tài)吸收光譜研究將為理解和掌握菌綠及其衍生物的熒光性能提供更有力的依據(jù)。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.5

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 胡銳;;新金屬菌綠素對HL-60腫瘤細胞光毒作用的參數(shù)研究[J];瓊州學院學報;2010年02期

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 黃櫻櫻;取代基對菌綠素類光敏劑的抗腫瘤活性影響的研究[D];廣西醫(yī)科大學;2016年

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 蘇小睿;鋅菌綠素光動力作用基礎(chǔ)研究[D];山西大學;2007年

本文編號：2572579