【摘要】：【研究背景和目的】近來(lái)生物信息學(xué)分析表明,人類(lèi)相當(dāng)數(shù)量的基因受microRNAs(miRNAs)的調(diào)控,miRNAs在多種生物的生命進(jìn)程中起到關(guān)鍵作用。與正常組織相比,腫瘤組織中的miRNAs表達(dá)譜發(fā)生變化,說(shuō)明腫瘤的發(fā)生發(fā)展與mi RNAs密切相關(guān)。在腫瘤組織中,mi RNAs充當(dāng)著致癌性或抑癌性的角色,調(diào)控其靶基因的表達(dá)和功能,參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。其中腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的致癌性miRNAs(Oncogenic miRNAs,OncomiRs)會(huì)滅活一些抑癌基因。因此針對(duì)這些高表達(dá)的致癌性miRNAs的靶向治療價(jià)值不可估量。目前,以miRNAs為靶點(diǎn)的腫瘤治療方案很多,其中有采用miRNAs抑制劑或反義序列封閉miRNAs的表達(dá)。但現(xiàn)有的治療大多針對(duì)單一的miRNA或其家族。由于miRNAs調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,一個(gè)miRNA可能調(diào)控多個(gè)靶基因,而一個(gè)靶基因也可能受多個(gè)miRNAs調(diào)控,因此針對(duì)單一miRNA表達(dá)的干預(yù)對(duì)腫瘤的抑制效果很有限。我們?cè)O(shè)想在細(xì)胞內(nèi)引入一條人工設(shè)計(jì)的干擾性長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Interfering long non-coding RNA,LncRNAi),該LncRNAi同時(shí)包含能與多個(gè)OncomiRs種子序列互補(bǔ)結(jié)合的序列,能夠與OncomiRs的靶基因mRNAs競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合OncomiRs,從而消耗細(xì)胞內(nèi)高水平的OncomiRs,對(duì)Oncomi Rs的抑癌性靶基因起保護(hù)作用。但是,這樣的競(jìng)爭(zhēng)性保護(hù)作用,需要競(jìng)爭(zhēng)者(即LncRNAi)的拷貝數(shù)要明顯高于被競(jìng)爭(zhēng)者(即OncomiRs)才能顯現(xiàn)良好的效果。本研究利用我們前期構(gòu)建并在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)能夠在肝癌中高拷貝增殖的溶瘤腺病毒載體,表達(dá)一種人工合成的LncRNAi。隨腺病毒在癌細(xì)胞中復(fù)制,實(shí)現(xiàn)LncRNAi在癌細(xì)胞中的大量表達(dá),競(jìng)爭(zhēng)性消耗OncomiRs,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的靶向干預(yù)治療�！狙芯糠椒ā�1、腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定:以我們前期構(gòu)建的survivin啟動(dòng)子調(diào)控的腫瘤特異性增殖腺病毒adsurp為載體,將12個(gè)在肝癌中高表達(dá)的oncomirs種子序列的互補(bǔ)序列(表1)串聯(lián)起來(lái)并重復(fù)6個(gè)拷貝數(shù)后,作為編碼lncrnai的基因序列,構(gòu)建表達(dá)lncrnai的腫瘤特異性增殖腺病毒adsvpe1a-lncr。同時(shí)構(gòu)建以綠色熒光蛋白報(bào)告基因(egfp)代替e1a的攜帶lncrnai的非增殖型陽(yáng)性對(duì)照腺病毒adsvpegfp-lncr,并以前期構(gòu)建的ad5-egfp為陰性對(duì)照腺病毒。2、細(xì)胞系培養(yǎng):肝癌細(xì)胞系(hepg2、hep3b、smmc-7721、mhcc97h、mhcc97l、huh-7、plc/prf/5)和正常肝細(xì)胞系(l02、wrl-68)來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞與生化研究所細(xì)胞庫(kù),按供應(yīng)商提供的方法培養(yǎng)。3、基因表達(dá)檢測(cè):上述細(xì)胞系感染不同強(qiáng)度的實(shí)驗(yàn)腺病毒和對(duì)照腺病毒,提取細(xì)胞總蛋白,采用westernblot方法檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)。4、腺病毒特異性增殖活性的檢測(cè):上述細(xì)胞系以moi=1pfu/cell感染adsvpe1a-lncr,以adsvpegfp-lncr為對(duì)照,分別在0h、24h、48h、72h時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,tcid50方法檢測(cè)病毒滴度。5、腺病毒介導(dǎo)的lncrnai表達(dá)檢測(cè):上述細(xì)胞系以moi=1pfu/cell感染adsvpe1a-lncr,以adsvpegfp-lncr為對(duì)照,常規(guī)rt-pcr以及實(shí)時(shí)定量rt-pcr(qrt-pcr)檢測(cè)lncrnai的表達(dá)。6、細(xì)胞增殖活性檢測(cè):通過(guò)四唑鹽比色實(shí)驗(yàn)(mtt法)檢測(cè)病毒adsvpe1a-lncr對(duì)肝癌細(xì)胞和正常細(xì)胞增殖的影響,以adsvpegfp-lncr和ad5-egfp為對(duì)照。7、遷移與侵襲實(shí)驗(yàn):上述細(xì)胞系以moi=1pfu/cell感染adsvpe1a-lncr,以adsvpegfp-lncr和ad5-egfp為病毒對(duì)照組,另設(shè)不加病毒的親代細(xì)胞同步培養(yǎng)作為空白對(duì)照,transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲能力。8、細(xì)胞周期和凋亡:上述細(xì)胞系以moi=1pfu/cell感染adsvpe1a-lncr,以adsvpegfp-lncr和ad5-egfp為病毒對(duì)照組,另設(shè)不加病毒的親代細(xì)胞同步培養(yǎng)作為空白對(duì)照,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。9、細(xì)胞蛋白表達(dá)譜變化的檢測(cè):huh-7細(xì)胞以moi=1pfu/cell的感染強(qiáng)度感染adsvpe1a-lncr,設(shè)ad5-egfp為陰性病毒對(duì)照,不加病毒的細(xì)胞同步培養(yǎng)作為空白對(duì)照。48h后,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)蛋白表達(dá)的變化。10、動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn):構(gòu)建小鼠肝癌移植瘤模型,實(shí)驗(yàn)病毒干預(yù)治療后,觀察記錄腫瘤生長(zhǎng)情況。【研究結(jié)果】1、腫瘤特異性增殖腺病毒在肝癌細(xì)胞中特異性增殖:本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的表達(dá)lncrnai的腫瘤特異性增殖腺病毒adsvpe1a-lncr,以腫瘤高特異性的survivin啟動(dòng)子調(diào)控e1a表達(dá),實(shí)現(xiàn)病毒的靶向特異性增殖。細(xì)胞感染adsvpe1a-lncr后,westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞表現(xiàn)為不同程度的survivin陽(yáng)性表達(dá),而正常肝細(xì)胞wrl-68、l02為survivin陰性表達(dá)。腺病毒e1a在肝癌細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)程度與survivin表達(dá)水平相一致,adsvpe1a-lncr在部分survivin高表達(dá)的肝癌細(xì)胞中特異性增殖復(fù)制的能力非常強(qiáng),最高達(dá)68465.66倍(huh-7),而在正常細(xì)胞l02、wrl-68中增殖不明顯。2、腫瘤特異性增殖腺病毒在肝癌細(xì)胞中介導(dǎo)lncrnai的表達(dá):adsvpe1a-lncr介導(dǎo)的lncrnai表達(dá),qrt-pcr檢測(cè)顯示,adsvpe1a-lncr介導(dǎo)的lncrnai表達(dá)水平,在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于正常肝細(xì)胞。3、腫瘤特異性增殖腺病毒表達(dá)lncrnai對(duì)肝癌細(xì)胞增殖活性有抑制作用:adsvpe1a-lncr對(duì)hep3b和huh-7殺傷活性最強(qiáng),hep3b存活率在moi=0.5pfu/cell時(shí)已下降到50%以下,在moi=2pfu/cell時(shí)已下降到10%以下;huh-7存活率在moi=1pfu/cell時(shí)已下降到50%以下,在moi=100pfu/cell時(shí)已下降到10%以下。adsvpe1a-lncr對(duì)其他肝癌細(xì)胞的殺傷也較強(qiáng),而對(duì)正-4-常肝細(xì)胞生物增殖無(wú)明顯影響。4、腫瘤特異性增殖腺病毒表達(dá)lncrnai對(duì)肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力有抑制作用:transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,與空白對(duì)照組相比,adsvpe1a-lncr對(duì)部分肝癌細(xì)胞的遷移侵襲能力有較強(qiáng)的抑制作用,其作用明顯強(qiáng)于非增殖的對(duì)照腺病毒adsvpegfp-lncr。adsvpe1a-lncr和adsvpegfp-lncr對(duì)正常肝細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力無(wú)明顯抑制作用。5、腫瘤特異性增殖腺病毒表達(dá)lncrnai誘導(dǎo)細(xì)胞周期的變化:實(shí)驗(yàn)腺病毒adsvpe1a-lncr和對(duì)照腺病毒adsvpegfp-lncr、ad5-egfp對(duì)正常肝細(xì)胞周期各時(shí)相無(wú)明顯作用,而對(duì)于肝癌細(xì)胞,adsvpe1a-lncr對(duì)細(xì)胞周期時(shí)相的變化因細(xì)胞不同而不同。plc/prf/5、hep3b、huh-7細(xì)胞表現(xiàn)為g0/g1期阻滯,而hepg2、mhcc97h細(xì)胞表現(xiàn)為s期阻滯。6、腫瘤特異性增殖腺病毒表達(dá)lncrnai誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡:本組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在感染adsvpe1a-lncr后,均表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡比例的升高,以hep3b、hepg2、plc/prf/5、huh-7細(xì)胞凋亡比例的升高最為明顯,而bel-7402、wrl-68和l02細(xì)胞凋亡比例的升高無(wú)統(tǒng)計(jì)差異。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞感染非增殖型對(duì)照腺病毒adsvpegfp-lncr后,其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性較弱。7、腫瘤特異性增殖腺病毒表達(dá)lncrnai影響細(xì)胞蛋白的表達(dá)譜:huh-7和hepg2細(xì)胞感染adsvpe1a-lncr后,基因表達(dá)譜變化明顯。檢出708個(gè)基因表達(dá)升高,以抑癌基因表達(dá)升高為主(pten、p27kip1、timp3、reck);檢出628個(gè)基因表達(dá)降低,以原癌基因表達(dá)降低為主(p38/mapk、survivin、cdk4、c-myc)。8、腫瘤特異性增殖腺病毒表達(dá)lncrnai對(duì)肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤有生長(zhǎng)抑制作用:肝癌細(xì)胞huh-7裸鼠移植瘤成瘤后,adsvpe1a-lncr治療組腫瘤生長(zhǎng)速度明顯低于空白對(duì)照組,治療第42天adsvpe1a-lncr組瘤體體積明顯低于治療前;adsvpegfp-lncr治療組在治療后28天后也較空白對(duì)照組也出現(xiàn)一定程度的生長(zhǎng)抑制,差別具有顯著意義,但瘤體仍在持續(xù)增長(zhǎng)中;ad5-EGFP組自始至終未出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制。【研究結(jié)論】以我們前期構(gòu)建、并在實(shí)驗(yàn)中得到有效性驗(yàn)證的Survivin啟動(dòng)子調(diào)控的腫瘤特異性增殖腺病毒為載體,表達(dá)一種人工設(shè)計(jì)合成的干擾性長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNAi),該LncRNAi包含一組(12個(gè))能夠通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)HCC癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的Oncomi Rs的種子序列的互補(bǔ)結(jié)合序列,包括miR-21、mi R-221/222、miR-224、miR-17-5p、mi R-10b、miR106b、miR-151-5p、mi R-155、mi R-181a/181b、miR-184、miR-1、miR-501。腫瘤特異性增殖腺病毒介導(dǎo)的LncRNAi表達(dá),可以競(jìng)爭(zhēng)性消耗Oncomi Rs,廣泛抑制OncomiRs相關(guān)的多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑,發(fā)揮更有效的抗癌效應(yīng)。這種方法克服了單一mi RNA干預(yù)腫瘤抑制效果有限、癌細(xì)胞通過(guò)旁路信號(hào)途徑重新獲得增殖活力的缺陷。以Survivin啟動(dòng)子調(diào)控腺病毒僅在Survivin陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞內(nèi)特異性增殖,釋放子代病毒殺傷更多的腫瘤細(xì)胞,而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)影響。同時(shí)其介導(dǎo)表達(dá)的LncRNAi只對(duì)OncomiRs起作用,因而使其安全性和有效性得以改善。本研究以肝癌高表達(dá)的部分OncomiRs為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的抗癌策略,不僅可用于肝癌的治療,同樣可為其他腫瘤的治療提供借鑒,為腫瘤治療建立一種療效可靠的技術(shù)平臺(tái)。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2572440