【摘要】：研究目的TRIM31 (tripartite motif-containing protein 31)是TRIM家族的一個成員。TRIM31由三個結(jié)構(gòu)域組成,分別是Ring結(jié)構(gòu)域,B-box結(jié)構(gòu)域和coiled-coil結(jié)構(gòu)域。由于Ring結(jié)構(gòu)域的存在,TRIM家族成員大都具有E3泛素酶的活性。之前研究發(fā)現(xiàn),TRIM家族成員能夠參與一系列機(jī)體的生理及病理過程,包括細(xì)胞生長、凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及腫瘤形成等。然而,TRIM家族成員在肝細(xì)胞肝癌中的研究較少,TRIM 31與腫瘤的關(guān)系,僅在胃癌和非小細(xì)胞肺癌中有研究,在肝癌及其它惡性腫瘤中并無相關(guān)研究報道。本課題旨在闡明TRIM31在肝細(xì)胞肝癌轉(zhuǎn)移和腫瘤進(jìn)展中的作用及相關(guān)分子機(jī)制。第一部分TRIM31在肝細(xì)胞肝癌惡性轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多步驟的過程。正常上皮細(xì)胞脫離細(xì)胞外基質(zhì)附著后會誘發(fā)凋亡,即“失巢凋亡”；而惡性腫瘤細(xì)胞獲得了抵抗失巢凋亡的能力,進(jìn)入脈管系統(tǒng)后能夠以錨定非依賴性的方式存活,是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要前提。本部分研究旨在闡明TRIM31在肝癌細(xì)胞抵抗失巢凋亡過程中的表達(dá)狀況、作用效應(yīng)及其分子機(jī)制,為闡明肝癌細(xì)胞抵抗失巢凋亡并進(jìn)一步侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制和對其進(jìn)行靶向逆轉(zhuǎn)奠定基礎(chǔ)。材料方法1.建立脫離附著的細(xì)胞模型1.1為模擬肝癌細(xì)胞在體內(nèi)原位生長以及脫離細(xì)胞外基質(zhì)附著繼續(xù)存活的狀態(tài),我們在體外將肝癌細(xì)胞接種于2-羥乙基甲基丙烯酸酯(poly-HEMA)覆蓋的培養(yǎng)板中,由此建立了肝癌細(xì)胞的失巢模型。1.2 Real-time PCR及Western blot方法檢測TRIM31在貼壁生長及失巢后的肝癌細(xì)胞中的表達(dá)差異。2. TRIM31對肝癌細(xì)胞抵抗失巢凋亡的影響培養(yǎng)細(xì)胞至指數(shù)生長期,用靶向TRIM31的SiRNA (Si-TRIM31)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞,并以無關(guān)序列做對照。構(gòu)建肝癌細(xì)胞失巢模型,用CCK-8法檢測干擾TRIM31后對肝癌細(xì)胞抵抗失巢凋亡效應(yīng)的影響。分別應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測干擾TRIM31后對失巢后的肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移力和克隆形成能力的影響。3. TRIM31發(fā)揮作用的信號通路及分子靶點(diǎn)檢測3.1培養(yǎng)細(xì)胞至指數(shù)生長期,用靶向TRIM31的SiRNA (Si-TRIM31)專染肝癌細(xì)胞,并以無關(guān)序列做對照。建立失巢的細(xì)胞模型,繼續(xù)培養(yǎng)24h后進(jìn)行蛋白提取。用Western Blot方法檢測細(xì)胞凋亡情況及凋亡通路變化。3.2應(yīng)用免疫共沉淀和Western blot等方法檢測TRIM31發(fā)揮作用的分子靶點(diǎn)及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. TRIM31在失巢后的肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)且介導(dǎo)肝癌細(xì)胞對失巢凋亡抵抗效應(yīng)1.1 TRIM31在失巢后的肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)用Real-time PCR及Western blot方法檢測結(jié)果顯示,與貼壁生長的肝癌細(xì)胞相比,TRIM31的mRNA水平及蛋白水平在失巢后的肝癌細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)。1.2 TRIM31介導(dǎo)肝癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗效應(yīng)將肝癌細(xì)胞接種于普通六孔板中,轉(zhuǎn)染TRIM31小干擾RNA(Si-TRIM31),并以轉(zhuǎn)染無關(guān)序列(Si-NC)組作為對照。經(jīng)過Real-time PCR及Western blot驗(yàn)證,靶向TRIM31的Si-TRIM31能夠顯著性抑制TRIM31的表達(dá)水平。1.2.1 TRIM31介導(dǎo)了肝癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗我們應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)對失巢后肝癌細(xì)胞的存活能力進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示,與對照組相比,Si-TRIM31轉(zhuǎn)染組失巢后肝癌細(xì)胞的死亡率大大提高。該結(jié)果提不,TRIM31的表達(dá)被抑制后,肝癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗被顯著逆轉(zhuǎn)。進(jìn)一步通過Western blot和Caspase-3剪切底物試劑盒對失巢后肝癌細(xì)胞的凋亡水平進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示干擾TRIM31表達(dá)后,失巢后的肝癌細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡反應(yīng)。該結(jié)果提示,TRIM31介導(dǎo)了肝癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗效應(yīng)。1.2.2 TRIM31參與介導(dǎo)了失巢后的肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與貼壁生長的肝癌細(xì)胞相比,失巢后的肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移力顯著增強(qiáng),而用小干擾RNA沉默TRIM31表達(dá)之后,穿過transwell上室膜的肝癌細(xì)胞明顯減少,提示TRIM31參與介導(dǎo)了失巢后肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)。1.2.3 TRIM31參與介導(dǎo)了失巢后的肝癌細(xì)胞的克隆形成克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,失巢后的肝癌細(xì)胞克隆形成能力顯著增強(qiáng),而用小干擾RNA沉默TRIM31的表達(dá)之后,失巢后的肝癌細(xì)胞的克隆形成能力明顯減弱,提示TRIM31介導(dǎo)了失巢后肝癌細(xì)胞的克隆形成能力的增強(qiáng)2. TRIM31通過活化AMPK信號通路介導(dǎo)肝癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗效應(yīng)2.1 AMPK通路的活化在肝癌細(xì)胞抵抗失巢凋亡中發(fā)揮重要作用培養(yǎng)細(xì)胞至指數(shù)生長期,構(gòu)建失巢的肝癌細(xì)胞模型,利用Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行信號通路篩選。Western blot結(jié)果顯示,失巢后的肝癌細(xì)胞中,AMPK通路明顯活化。應(yīng)用AMPK信號通路的抑制劑Compound C對其進(jìn)行封閉后,肝癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗效應(yīng)、以及失巢后肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移力和克隆形成能力都顯著降低。提示AMPK通路的活化在肝癌細(xì)胞抵抗失巢凋亡中發(fā)揮重要作用。2.2 TRIM31通過活化AMPK信號通路介導(dǎo)肝癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗效應(yīng)在前期證實(shí)AMPK通路在失巢后肝癌細(xì)胞活化的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步檢測了TRIM31介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗效應(yīng)是否通過AMPK通路的活化介導(dǎo)的。結(jié)果顯示,Si-TRIM31轉(zhuǎn)染組能夠有效逆轉(zhuǎn)失巢后肝癌細(xì)胞中AMPK通路的活化效應(yīng)。而應(yīng)用AMPK信號通路的抑制劑Compound C作用后,TRIM31所介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗效應(yīng),以及失巢后肝癌細(xì)胞所增強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力及克隆形成能力都得到了有效的逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果提示,TRIM31所介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗效應(yīng)及相關(guān)的惡性行為是通過活化AMPK通路實(shí)現(xiàn)的。3. TRIM31通過直接靶向降解P53分子,介導(dǎo)肝癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗效應(yīng)為了明確TRIM31的分子靶點(diǎn),我們進(jìn)行了免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TRIM31能夠直接結(jié)合并負(fù)向調(diào)控AMPK上游的P53分子,而進(jìn)一步的免疫沉淀和Western blot結(jié)果顯示,TRIM31能夠通過Ring結(jié)構(gòu)域?qū)53進(jìn)行K48位泛素化降解而實(shí)現(xiàn)對其負(fù)向調(diào)控,并介導(dǎo)AMPK通路的活化和肝癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗效應(yīng)。進(jìn)一步研究顯示,P53在失巢后肝癌中的外源性過表達(dá),能夠有效逆轉(zhuǎn)TRIM31所介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗效應(yīng)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,TRIM31是肝癌細(xì)胞抵抗失巢凋亡的關(guān)鍵基因,為臨床靶向TRIM31治療轉(zhuǎn)移性肝癌的治療策略探索奠定了基礎(chǔ)。結(jié)論1. TRIM31在抵抗失巢凋亡的肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),并能夠通過活化AMPK通路介導(dǎo)肝癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗效應(yīng)2. TRIM31能夠直接結(jié)合和泛素化降解P53分子,進(jìn)而活化AMPK通路并介導(dǎo)肝癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗效應(yīng),外源性過表達(dá)P53分子能夠有效逆轉(zhuǎn)TRIM31在肝癌細(xì)胞失巢凋亡抵抗中的作用。創(chuàng)新點(diǎn)及意義1.首次證實(shí)了TRIM31介導(dǎo)了肝癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗效應(yīng),為闡明肝癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制和對其進(jìn)行靶向逆轉(zhuǎn)奠定了基礎(chǔ)。2.首次發(fā)現(xiàn)TRIM31對AMPK通路的調(diào)控效應(yīng),為逆轉(zhuǎn)肝癌轉(zhuǎn)移提供了新的分子靶點(diǎn)。3.首次發(fā)現(xiàn)p53基因是TRIM31的直接靶點(diǎn),而TRIM31對P53的靶向降解介導(dǎo)了肝癌細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗,為肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的闡明和對其在分子水平進(jìn)行早期干預(yù)奠定了基礎(chǔ)。第二部分TRIM31在肝細(xì)胞肝癌發(fā)生與進(jìn)展中的作用與分子機(jī)制肝細(xì)胞肝癌是全球范圍內(nèi)僅次于肺癌和胃癌的癌癥第三大死因,而目前肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生機(jī)理和進(jìn)展機(jī)制尚不明確,對此問題的深入研究和探討,將從分子水平闡明肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,對肝細(xì)胞肝癌的預(yù)防、靶向治療及預(yù)后干預(yù)都具有重要意義。本部分旨在研究闡明TRIM31在肝細(xì)胞肝癌進(jìn)展中的作用及相關(guān)分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. TRIM31在肝癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)并參與肝癌的進(jìn)展1.1 TRIM31在肝癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)1.1.1我們從山東省立醫(yī)院收集了108對臨床病人的肝癌組織及相應(yīng)遠(yuǎn)端非癌肝組織,提取蛋白之后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與遠(yuǎn)端非癌肝組織相比,TRM31在肝癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)。1.1.2為了驗(yàn)證Western blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們另取104對臨床病人的肝癌組織及遠(yuǎn)端非癌肝組織做石蠟切片進(jìn)行免疫組合檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TRIM31主要表達(dá)在肝癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,并且與遠(yuǎn)端非癌肝組織相比,肝癌組織中TRIM31染色較深,表明TRIM31在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)。1.1.3 Spearman相關(guān)分析顯示,TRIM31在肝癌組織中的表達(dá)水平與肝癌的腫瘤大小、臨床分期及TNM分級呈顯著正相關(guān),提示TRIM31在肝癌組織中的表達(dá)上調(diào)可能參與促進(jìn)了肝癌的進(jìn)程。1.2 TRIM31參與促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的惡性行為在TRIM31基礎(chǔ)表達(dá)量較低的肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TRIM31真核表達(dá)載體及相應(yīng)空載體作對照,構(gòu)建TRIM31過表達(dá)模型；同時在TRIM31基礎(chǔ)表達(dá)量較高的肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TRIM31小干擾RNA及相應(yīng)無關(guān)序列作對照,構(gòu)建TRIM31表達(dá)沉默模型,通過CCK-8法檢測細(xì)胞活力,transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力,克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的克隆形成能力。正反兩方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TRIM31的過表達(dá)顯著促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移以及克隆形成能力；而TRIM31表達(dá)受到抑制之后,細(xì)胞的惡性行為均受到有效抑制。結(jié)果提示,TRIM31能夠顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞惡性行為的進(jìn)展。2. TRIM31通過活化mTORCl通路發(fā)揮對肝癌細(xì)胞惡性行為的促進(jìn)作用2.1分別構(gòu)建TRIM31過表達(dá)及干擾表達(dá)的肝癌細(xì)胞模型,應(yīng)用Western blot檢測細(xì)胞模型中信號通路的活化狀況。Western blot結(jié)果顯示,TRIM31能夠明顯活化mTORC1通路以及下游分子S6K1,S6,及HIF-1α,提示TRIM31能夠顯著促進(jìn)mTORC1通路的活化。2.2應(yīng)用mTORC1通路的特異性抑制劑雷帕霉素對肝癌細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后,將TRIM31表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞以構(gòu)建TRIM31過表達(dá)的肝癌模型。Western blot結(jié)果證實(shí)nTORC1通路能夠被雷帕霉素有效封閉,而進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示,mTORC1通路被抑制之后,TRIM31對肝癌細(xì)胞的惡性行為進(jìn)展促進(jìn)作用也被有效抑制。這些結(jié)果提示,TRIM31對肝癌細(xì)胞惡性行為的促進(jìn)效應(yīng)是通過mTORC1通路的活化所介導(dǎo)的。3. TRIM31在肝癌細(xì)胞中通過直接靶向結(jié)合并降解TSC1和TSC2發(fā)揮效應(yīng)3.1 TRIM31通過靶向降解TSC1和TSC2發(fā)揮促癌作用3.1.1分別構(gòu)建TRIM31過表達(dá)及干擾表達(dá)的肝癌細(xì)胞模型,應(yīng)用Western blot檢測TRIM31對mTORC1上游的負(fù)向調(diào)控分子,TSC1-TSC2復(fù)合體的表達(dá)調(diào)控。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TRIM31的過表達(dá)能夠抑制TSC1及TSC2的表達(dá),而抑制TRIM31的表達(dá)之后,TSC1及TSC2的表達(dá)上調(diào)。同時應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132之后,TRIM31對TSC1和TSC2的負(fù)向調(diào)控效應(yīng)消失,提示TRIM31對TSC1-TSC2的負(fù)向調(diào)控效應(yīng)是通過蛋白酶體途徑介導(dǎo)的。TRIM31的Ring結(jié)構(gòu)域缺失突變體(FLAG-TRIM31-C58)和點(diǎn)突變體(FLAG-TRIM31-36A)均沒有對TSC1和TSC2的負(fù)向調(diào)控效應(yīng)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,TRIM31可以通過Ring結(jié)構(gòu)域發(fā)揮對TSC1及TSC2的負(fù)向調(diào)控效應(yīng)。3.1.2免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TRIM31能夠直接靶向結(jié)合TSC1及TSC2。同時TRIM31通過Ring結(jié)構(gòu)域?qū)SC1和TSC2進(jìn)行K48位泛素化修飾。IP實(shí)驗(yàn)和Western blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),TRIM31能夠與TSC1和TSC2直接結(jié)合,并通過Ring結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)對其進(jìn)行K48位泛素化修飾降解。這些結(jié)果提示,TSC1和TSC2是TR1M31發(fā)揮對肝癌細(xì)胞中mTORC1通路抑制效應(yīng)的分子靶點(diǎn)。3.2 TSC1和TSC2的外源性過表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)TR I M31的促癌作用在肝癌細(xì)胞中進(jìn)行TRIM31、TSC1和/或TSC2的共轉(zhuǎn)染之后,檢測細(xì)胞生物學(xué)活性檢測,并以空載體轉(zhuǎn)染組作為對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TSC1和/或TSC2的過表達(dá)能夠有效逆轉(zhuǎn)TRIM31對肝癌細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力等一系列惡性行為的促進(jìn)效應(yīng)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,TRIM31發(fā)揮促癌作用是通過其對TSC1-TSC2復(fù)合體的直接靶向泛素化降解而實(shí)現(xiàn)的。結(jié)論1.TRIM31在肝癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào),并且TRIM31的表達(dá)與腫瘤大小、臨床分期、病理分級呈正相關(guān)。提示TRIM31在肝癌組織中的過表達(dá)促進(jìn)了肝癌的進(jìn)展。2.TRIM31對肝癌惡性行為的促進(jìn)效應(yīng)是通過其活化mTORC1通路實(shí)現(xiàn)的。3. TRIM31能夠直接靶向TSC1-TSC2復(fù)合體,并對其進(jìn)行泛素化降解,進(jìn)而激活mTORC1通路,促進(jìn)肝癌的惡性行為。創(chuàng)新點(diǎn)及意義1.本課題首次在臨床肝癌組織標(biāo)本中檢測了TRIM31的表達(dá),并分析了其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性,揭示了TRIM31在肝癌發(fā)生發(fā)展中的重要促進(jìn)作用,為其在腫瘤免疫領(lǐng)域的進(jìn)一步研究提供了新思路。2.本課題首次發(fā)現(xiàn)TRIM31對mTORC1信號通路的活化效應(yīng),為闡明]TRIM31發(fā)揮效應(yīng)的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。3.本研究首次揭示TRIM31能夠直接靶向TSC1-TSC2復(fù)合體并對其進(jìn)行泛素化降解,進(jìn)而解除其對mTORC1通路的抑制效應(yīng),活化該通路并促進(jìn)肝癌的進(jìn)程,為肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的闡明和對其進(jìn)行早期干預(yù)奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2572357