【摘要】：白血病細胞的遷移是其發(fā)生浸潤的關(guān)鍵步驟,基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)能通過引發(fā)相應(yīng)的信號通路引起細胞遷移,細胞遷移過程與細胞骨架的變化密切相關(guān),而RhoGTP酶主要調(diào)控肌動蛋白細胞骨架,因此本論文研究RhoGTP酶家族的主要成員Rho在SDF-1引起的白血病細胞遷移過程中的作用。本論文首先用不同濃度的SDF-1(0、25、50、100和200 ng/ml)刺激Jurkat細胞,Transwell實驗觀察細胞遷移情況;接著用細胞骨架的抑制劑處理Jurkat細胞,驗證細胞遷移與細胞骨架的關(guān)系;隨后激光共聚焦顯微鏡觀察和流式細胞術(shù)檢測SDF-1刺激Jurkat細胞后細胞骨架的變化情況。在此基礎(chǔ)上,研究細胞內(nèi)重要信號效應(yīng)分子ROS和NO在SDF-1引起的Jurkat細胞遷移過程中的作用。首先SDF-1刺激Jurkat細胞后,流式細胞術(shù)檢測ROS的產(chǎn)生情況,酶標儀檢測NO的產(chǎn)生情況;接著探究ROS和NO是否參與SDF-1誘導(dǎo)的Jurkat細胞骨架的變化和細胞遷移;隨后用Rho的抑制劑處理Jurkat細胞,檢測SDF-1刺激后ROS和NO的產(chǎn)生與Rho的關(guān)系;然后研究Rho是否參與SDF-1引起的Jurkat細胞骨架變化和細胞遷移;Western Blot實驗進一步檢測SDF-1刺激Jurkat細胞后,RhoA、RhoB和RhoC的活化情況;最后siRNA轉(zhuǎn)染干涉RhoA和RhoC的表達,Transwell實驗研究RhoA和RhoC是否都參與SDF-1引起的Jurkat細胞遷移。另外,為了進一步研究RhoA和RhoC在SDF-1引起的Jurkat細胞遷移過程中的作用,將它們的抑制因子RhoGDI2進行干涉,熒光顯微鏡觀察Jurkat細胞的侵染效率、Western Blot鑒定RhoGDI2 shRNA在Jurkat細胞內(nèi)的表達情況。實驗結(jié)果如下:1.SDF-1通過改變細胞骨架的重排和聚合參與Jurkat細胞遷移SDF-1引起的Jurkat細胞遷移具有濃度依賴效應(yīng),隨著濃度的增大,遷移現(xiàn)象越明顯;細胞松弛素B預(yù)處理Jurkat細胞,SDF-1刺激4 h,細胞遷移現(xiàn)象極顯著地受到抑制;SDF-1刺激4 h,Jurkat細胞骨架發(fā)生重排和聚合。2.ROS和NO通過改變細胞骨架的重排和聚合參與SDF-1引起的Jurkat細胞遷移SDF-1刺激Jurkat細胞0、1、2、3和4 h,細胞內(nèi)ROS和NO的表達水平在4 h時極顯著地高于對照組;NAC和L-NMMA預(yù)處理Jurkat細胞,SDF-1刺激4 h,細胞骨架的重排和聚合現(xiàn)象以及細胞遷移現(xiàn)象都極顯著地受到抑制。3.RhoA和RhoC通過改變細胞骨架的重排和聚合參與SDF-1引起的Jurkat細胞遷移CT04預(yù)處理Jurkat細胞,SDF-1刺激細胞4 h,極顯著地抑制了ROS和NO的表達、細胞骨架的重排和聚合以及細胞遷移;Jurkat細胞內(nèi)只表達RhoA和RhoC,不表達RhoB;SDF-1刺激4 h,RhoA和RhoC都發(fā)生活化;RhoA和RhoC都參與SDF-1引起的Jurkat細胞遷移;構(gòu)建質(zhì)粒RhoGDI2 shRNA,包裝病毒并侵染Jurkat細胞,RhoGDI2sh1和sh2均能顯著降低Jurkat細胞內(nèi)RhoGDI2的表達量。由以上研究結(jié)果得出如下結(jié)論:1.SDF-1可以引起Jurkat細胞發(fā)生遷移、細胞骨架發(fā)生重排和聚合,并且通過改變細胞骨架的重排和聚合參與SDF-1引起的Jurkat細胞遷移。2.SDF-1可以引起Jurkat細胞內(nèi)ROS和NO的產(chǎn)生,ROS和NO通過改變細胞骨架的重排和聚合參與SDF-1引起的Jurkat細胞遷移。3.SDF-1引起Jurkat細胞內(nèi)ROS和NO的產(chǎn)生依賴于Rho的活化,SDF-1刺激后可使Jurkat細胞內(nèi)RhoA和Rho C活化,并且RhoA和RhoC通過改變細胞骨架的重排和聚合參與SDF-1引起的Jurkat細胞遷移。構(gòu)建的RhoGDI2 shRNA慢病毒表達質(zhì)粒成功侵染Jurkat細胞并抑制了RhoA和RhoC調(diào)控因子RhoGDI2的表達。本論文著重研究Rho在SDF-1引起的Jurkat細胞遷移中的作用,闡明了此過程中的相關(guān)信號通路,為研究SDF-1引起的急性淋巴細胞白血病細胞遷移機制提供了可靠的理論依據(jù),為治療白血病提供了新的作用靶點。
【圖文】：

最終用 PBS 重懸后，，流式細胞儀檢測的熒光值，將結(jié)果表示為相對熒光指數(shù)（RFI）。采用 SPSS 17.0 軟件分析，各處理組與對照組的比較OVA），結(jié)果用平均值±標準差（Mean ± SD）表示流式細胞儀檢測的結(jié)果采用 Flowjo 軟件分析。起 Jurkat 細胞遷移 實驗觀察統(tǒng)計細胞的相對遷移倍數(shù)，結(jié)果如圖 2.1 0 和 200 ng/ml 均可以極顯著地引起 Jurkat 細胞遷移、19.7、33.3 和 51.2，并且 Jurkat 細胞相對遷移倍數(shù)DF-1 濃度越大，細胞遷移能力越強。

connection between SDF-1-induced cytoskeletal changes and migra(n=3) （**p<0.01） 引起 Jurkat 細胞骨架重排聚焦顯微鏡觀察細胞骨架的變化情況如圖 2.3 所示：FISDF-1（25 ng/ml）刺激細胞 4 h，對照組中細胞骨架呈現(xiàn)細胞骨架發(fā)生了重排現(xiàn)象。結(jié)果表明 SDF-1 刺激后，Jur
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R733.7

【參考文獻】

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本文編號：2572003