【摘要】：白血病細(xì)胞的遷移是其發(fā)生浸潤(rùn)的關(guān)鍵步驟,基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)能通過(guò)引發(fā)相應(yīng)的信號(hào)通路引起細(xì)胞遷移,細(xì)胞遷移過(guò)程與細(xì)胞骨架的變化密切相關(guān),而RhoGTP酶主要調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架,因此本論文研究RhoGTP酶家族的主要成員Rho在SDF-1引起的白血病細(xì)胞遷移過(guò)程中的作用。本論文首先用不同濃度的SDF-1(0、25、50、100和200 ng/ml)刺激Jurkat細(xì)胞,Transwell實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移情況;接著用細(xì)胞骨架的抑制劑處理Jurkat細(xì)胞,驗(yàn)證細(xì)胞遷移與細(xì)胞骨架的關(guān)系;隨后激光共聚焦顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SDF-1刺激Jurkat細(xì)胞后細(xì)胞骨架的變化情況。在此基礎(chǔ)上,研究細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)效應(yīng)分子ROS和NO在SDF-1引起的Jurkat細(xì)胞遷移過(guò)程中的作用。首先SDF-1刺激Jurkat細(xì)胞后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS的產(chǎn)生情況,酶標(biāo)儀檢測(cè)NO的產(chǎn)生情況;接著探究ROS和NO是否參與SDF-1誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞骨架的變化和細(xì)胞遷移;隨后用Rho的抑制劑處理Jurkat細(xì)胞,檢測(cè)SDF-1刺激后ROS和NO的產(chǎn)生與Rho的關(guān)系;然后研究Rho是否參與SDF-1引起的Jurkat細(xì)胞骨架變化和細(xì)胞遷移;Western Blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)SDF-1刺激Jurkat細(xì)胞后,RhoA、RhoB和RhoC的活化情況;最后siRNA轉(zhuǎn)染干涉RhoA和RhoC的表達(dá),Transwell實(shí)驗(yàn)研究RhoA和RhoC是否都參與SDF-1引起的Jurkat細(xì)胞遷移。另外,為了進(jìn)一步研究RhoA和RhoC在SDF-1引起的Jurkat細(xì)胞遷移過(guò)程中的作用,將它們的抑制因子RhoGDI2進(jìn)行干涉,熒光顯微鏡觀察Jurkat細(xì)胞的侵染效率、Western Blot鑒定RhoGDI2 shRNA在Jurkat細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.SDF-1通過(guò)改變細(xì)胞骨架的重排和聚合參與Jurkat細(xì)胞遷移SDF-1引起的Jurkat細(xì)胞遷移具有濃度依賴(lài)效應(yīng),隨著濃度的增大,遷移現(xiàn)象越明顯;細(xì)胞松弛素B預(yù)處理Jurkat細(xì)胞,SDF-1刺激4 h,細(xì)胞遷移現(xiàn)象極顯著地受到抑制;SDF-1刺激4 h,Jurkat細(xì)胞骨架發(fā)生重排和聚合。2.ROS和NO通過(guò)改變細(xì)胞骨架的重排和聚合參與SDF-1引起的Jurkat細(xì)胞遷移SDF-1刺激Jurkat細(xì)胞0、1、2、3和4 h,細(xì)胞內(nèi)ROS和NO的表達(dá)水平在4 h時(shí)極顯著地高于對(duì)照組;NAC和L-NMMA預(yù)處理Jurkat細(xì)胞,SDF-1刺激4 h,細(xì)胞骨架的重排和聚合現(xiàn)象以及細(xì)胞遷移現(xiàn)象都極顯著地受到抑制。3.RhoA和RhoC通過(guò)改變細(xì)胞骨架的重排和聚合參與SDF-1引起的Jurkat細(xì)胞遷移CT04預(yù)處理Jurkat細(xì)胞,SDF-1刺激細(xì)胞4 h,極顯著地抑制了ROS和NO的表達(dá)、細(xì)胞骨架的重排和聚合以及細(xì)胞遷移;Jurkat細(xì)胞內(nèi)只表達(dá)RhoA和RhoC,不表達(dá)RhoB;SDF-1刺激4 h,RhoA和RhoC都發(fā)生活化;RhoA和RhoC都參與SDF-1引起的Jurkat細(xì)胞遷移;構(gòu)建質(zhì)粒RhoGDI2 shRNA,包裝病毒并侵染Jurkat細(xì)胞,RhoGDI2sh1和sh2均能顯著降低Jurkat細(xì)胞內(nèi)RhoGDI2的表達(dá)量。由以上研究結(jié)果得出如下結(jié)論:1.SDF-1可以引起Jurkat細(xì)胞發(fā)生遷移、細(xì)胞骨架發(fā)生重排和聚合,并且通過(guò)改變細(xì)胞骨架的重排和聚合參與SDF-1引起的Jurkat細(xì)胞遷移。2.SDF-1可以引起Jurkat細(xì)胞內(nèi)ROS和NO的產(chǎn)生,ROS和NO通過(guò)改變細(xì)胞骨架的重排和聚合參與SDF-1引起的Jurkat細(xì)胞遷移。3.SDF-1引起Jurkat細(xì)胞內(nèi)ROS和NO的產(chǎn)生依賴(lài)于Rho的活化,SDF-1刺激后可使Jurkat細(xì)胞內(nèi)RhoA和Rho C活化,并且RhoA和RhoC通過(guò)改變細(xì)胞骨架的重排和聚合參與SDF-1引起的Jurkat細(xì)胞遷移。構(gòu)建的RhoGDI2 shRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒成功侵染Jurkat細(xì)胞并抑制了RhoA和RhoC調(diào)控因子RhoGDI2的表達(dá)。本論文著重研究Rho在SDF-1引起的Jurkat細(xì)胞遷移中的作用,闡明了此過(guò)程中的相關(guān)信號(hào)通路,為研究SDF-1引起的急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞遷移機(jī)制提供了可靠的理論依據(jù),為治療白血病提供了新的作用靶點(diǎn)。
【圖文】：

最終用 PBS 重懸后，，流式細(xì)胞儀檢測(cè)的熒光值，將結(jié)果表示為相對(duì)熒光指數(shù)（RFI）。采用 SPSS 17.0 軟件分析，各處理組與對(duì)照組的比較OVA），結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean ± SD）表示流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果采用 Flowjo 軟件分析。起 Jurkat 細(xì)胞遷移 實(shí)驗(yàn)觀察統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的相對(duì)遷移倍數(shù)，結(jié)果如圖 2.1 0 和 200 ng/ml 均可以極顯著地引起 Jurkat 細(xì)胞遷移、19.7、33.3 和 51.2，并且 Jurkat 細(xì)胞相對(duì)遷移倍數(shù)DF-1 濃度越大，細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)。

connection between SDF-1-induced cytoskeletal changes and migra(n=3) （**p<0.01） 引起 Jurkat 細(xì)胞骨架重排聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架的變化情況如圖 2.3 所示：FISDF-1（25 ng/ml）刺激細(xì)胞 4 h，對(duì)照組中細(xì)胞骨架呈現(xiàn)細(xì)胞骨架發(fā)生了重排現(xiàn)象。結(jié)果表明 SDF-1 刺激后，Jur
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R733.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2572003