【摘要】：肺癌是全球發(fā)病率居于首位的惡性腫瘤,全球每年新發(fā)肺癌120萬例,我國每年有60萬人死于肺癌。在我國城市因腫瘤而死亡的人口中,肺癌列居首位。組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases, HDACs)是維持染色體的基本組成單位核小體中組蛋白乙�；胶獾年P(guān)鍵酶類之一,其作用為催化組蛋白的去乙酰化,與基因的轉(zhuǎn)錄與抑制有密切的關(guān)系,涉及基因沉默的復雜過程,是抗腫瘤藥物設(shè)計作用的熱門靶點。組蛋白去乙酰化酶2 (HDAC2)是組蛋白去乙�；�(HDACs)家族的成員之一,在胚胎及哺乳動物細胞中廣泛表達,幾乎參與所有細胞功能,包括細胞增殖、凋亡、分化等。目前發(fā)現(xiàn)許多腫瘤都存在HDAC2高表達,并且在不同腫瘤中的作用機制不一致,在肺癌中的作用目前尚未有明確統(tǒng)一的報道。本課題從細胞和組織水平上探討HDAC2在人肺腺癌中的作用,利用細胞和分子生物學技術(shù),通過RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)沉默人肺腺癌A549細胞中HDAC2的表達,研究HDAC2基因在體外環(huán)境中對人肺腺癌A549細胞生物學行為的影響及其機制；收集人肺腺癌及其癌旁組織,采用RT-PCR法、Western blot及免疫熒光法檢測人肺腺癌及其癌旁組織中HDAC2的表達,探討HDAC2與臨床病理的關(guān)系。研究內(nèi)容包括以下三部分：第一部分 組蛋白去乙�；�2在肺腺癌組織中的表達目的：檢測肺腺癌組織和相應(yīng)癌旁組織中HDAC2mRNA和HDAC2的表達情況。方法：收集經(jīng)廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科確診的人肺腺癌患者手術(shù)標本30例,相應(yīng)癌旁組織作為對照,運用Western blot法及免疫熒光法檢測肺腺癌組織及癌旁組織中HDAC2的表達水平,RT-PCR檢測HDAC2mRNA表達水平。結(jié)果：1、RT-PCR結(jié)果示30例肺腺癌組織及癌旁組織結(jié)果顯示,肺癌組織HDAC2mRNA相對表達量低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2、Western blot檢測肺腺癌及癌旁組織HDAC2表達灰度值結(jié)果顯示,肺腺癌組與對照組比較,其HDAC2表達量下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3、免疫熒光結(jié)果示HDAC2在人肺腺癌組織切片和對照組細胞漿和細胞核均有表達,表現(xiàn)為綠色熒光。人肺腺癌組織切片免疫熒光染色結(jié)果顯示,人肺腺癌組織的熒光強度較癌旁組織弱,差異具有統(tǒng)計學意義，(P0.05)。結(jié)論：HDAC2在人肺腺癌組織中表達較癌旁組織低,提示HDAC2與肺腺癌相關(guān)。第二部分紅霉素對A549細胞HDAC2的影響目的：肺癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一,本文探討紅霉素(EM)對煙草煙霧提取物(CSE)刺激肺腺癌A549細胞的組蛋白去乙�；�2(HDAC2)的作用。研究EM對順鉑(CDDP)誘導A549細胞凋亡作用的影響,及其對A549細胞周期的影響。方法：以A549細胞為研究對象,予CSE以及EM、CDDP作用。(1)藥物濃度以及作用時間的確定：CSE濃度為0.5%、1%、2.5%、5%,EM濃度為10、20、40、80μg/ml。實驗分組：①空白對照組(只加10%滅活胎牛血清FBS的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液)；②0.5%CSE組；③0.5%CSE+10μg/ml EM組。分別用不同濃度CSE和不同濃度EM處理A549細胞,然后用光學倒置顯微鏡觀察A549細胞的生長形態(tài)；用CCK-8法檢測不同濃度CSE、EM在不同時間對A549細胞活性的影響；用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法檢測不同濃度CSE或不同濃度EM處理A549細胞后,細胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-8、TNF-α濃度；用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot, WB)檢測各組A549細胞HDAC2的表達;RT-PCR分別檢測各組細胞HDAC2mRNA、IL-6mRNA、IL-8mRNA. TNF-amRNA的表達。(2)以A549細胞為研究對象,配制CDDP濃度為0.25mg/L、0.5mg/L. 1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L。不同濃度CDDP刺激A549細胞48h,用CCK-8法檢測不同濃度CDDP處理A549細胞后的細胞活性,并分別計算CDDP各自的半數(shù)抑制濃度(50% inhibiting concentration, IC50)。將實驗分組為,①空白對照組(只加10%滅活FBS的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液)；②EM組；③IC50-CDDP+10μg/ml EM。各組細胞培養(yǎng)48h后,流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡、細胞周期百分比。結(jié)果：(1)CCK-8法檢測各組A549細胞活性。與空白對照組比較,0.5%CSE處理細胞24、48小時和1%CSE處理細胞24小時,10μg/ml EM處理細胞24、48小時,細胞活性未見明顯抑制,差異不具統(tǒng)計學意義(p0.05)。而其他各CSE、EM組細胞活性均受到不同程度抑制,差異均具有統(tǒng)計學意義(p0.05),并且在一定范圍內(nèi)呈劑量和時間依賴性,藥物劑量越大,培養(yǎng)時間越長,細胞生長受抑制程度也越嚴重。(2) ELISA法檢測各組A549細胞的IL-6、IL-8和TNF-a含量。與空白對照組比較,0.5%CSE處理A549細胞24、48小時,1%CSE處理細胞24小時,細胞分泌IL-6、IL-8和TNF-a均增高,差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。其他各CSE組細胞分泌的IL-6、IL-8和TNF-a均下降,而且隨著CSE濃度增高或者培養(yǎng)時間延長,炎癥因子分泌下降越嚴重,差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。與空白對照組比較,在不同時間用不同濃度EM處理A549細胞,炎癥因子分泌均受到抑制,并且呈劑量和時間依賴性,EM劑量越大,培養(yǎng)時間越長,炎癥因子分泌受抑制程度越嚴重,差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。(3)與空白對照組比較,0.5%CSE處理后的A549細胞HDAC2mRNA表達量下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。而與0.5%CSE組對比,10μg/mlEM可以上調(diào)煙草煙霧暴露的A549細胞HDAC2mRNA表達量,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(4)與空白對照組比較,0.5%CSE處理A549細胞后,IL-6mRNA、 IL-8mRNA和TNF-amRNA表達均增高,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；與0.5%CSE組對比,10μg/ml EM可以降低煙草煙霧暴露的A549細胞IL-8mRNA和TNF-amRNA的表達,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(5)CCK-8結(jié)果提示,不同濃度CDDP處理A549細胞48h,細胞生長受到不同程度抑制,并且呈濃度抑制依賴性,濃度越高,對細胞生長抑制作用越大,與空白對照組相比,差異均具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。IC50-CDDP為3.449 mg/L。(6) IC50-CDDP作用于EM預處理的A549細胞48h后,與空白對照組比較,早期細胞凋亡增多,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。細胞周期結(jié)果顯示細胞周期G0/G1期比例增加,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。(7)與空白對照組比較,10μg/ml EM刺激A549細胞后,細胞周期G0/G1期比例增加,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。但細胞凋亡無明顯增加(p0.05)。結(jié)論：1.0.5%CSE可使A549細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng),而EM可抑制煙草煙霧暴露的A549細胞的炎癥反應(yīng),其作用機制可能是通過上調(diào)煙草煙霧暴露的A549細胞HDAC2活性而產(chǎn)生作用。2.EM可增強CDDP對A549細胞的細胞阻滯作用,其機制可能與EM調(diào)節(jié)的HDAC2表達增加引起的CyclinD1的活性下降有關(guān)。3.EM可增強CDDP對A549細胞的凋亡作用,其機制可能與EM可提高A549細胞的HDAC2表達,從而促進凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、caspase-3表達增加密切相關(guān)。因此EM聯(lián)合CDDP可考慮作為治療肺腺癌合并有肺部炎癥性疾病患者的新型藥物組合。結(jié)論：1.0.5%CSE可使A549細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng),而EM可抑制煙草煙霧暴露的A549細胞的炎癥反應(yīng),其作用機制可能是通過上調(diào)煙草煙霧暴露的A549細胞HDAC2活性而產(chǎn)生作用。2.EM可增強CDDP對A549細胞的細胞阻滯作用,其機制可能與EM調(diào)節(jié)的HDAC2表達增加引起的CyclinD1的活性下降有關(guān)。3.EM可增強CDDP對A549細胞的凋亡作用,其機制可能與EM可提高A549細胞的HDAC2表達,從而促進凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、caspase-3表達增加密切相關(guān)。因此EM聯(lián)合CDDP可考慮作為治療肺腺癌合并有肺部炎癥性疾病患者的新型藥物組合。第三部分RNAi沉默A549細胞HDAC2基因?qū)t霉素作用的影響目的：采用LV-HDAC2-RNAi慢病毒載體轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細胞,觀察沉默HDAC2基因在體外對人肺腺癌A549細胞生物學行為的影響,并探討EM對其作用機制。方法：使用LV-HDAC2-RNAi慢病毒載體及空載質(zhì)粒病毒載體轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細胞,并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株分別命名為實驗組(RNAi-A549)和陰性對照組(NC-A549)。通過熒光定量PCR、Western blot、ELISA等方法檢測EM對實驗組(RNAi-A549)、陰性對照組(NC-A549)和空白組(A549)中HDAC2、caspase-9、caspase-3以及CyclinDl的表達情況,以驗證EM通過調(diào)節(jié)HDAC2的表達對A549細胞的抗炎、促進凋亡等效果。結(jié)果：1、熒光定量PCR, Western blot及免疫熒光染色結(jié)果均顯示,實驗組細胞HDAC2 mRNA和HDAC2蛋白的表達明顯低于兩組對照組(P0.05);2、EM對RNAi-A549細胞功能明顯受到抑制,caspase-3 mRNA以及caspase-9 mRNA表達在RNAi-A549組中明顯下降,cyclinD1mRNA在RNAi-A549組表達升高。結(jié)論：1、成功構(gòu)建并篩選出穩(wěn)定沉默HDAC2基因的實驗組(RNAi-A549)和空載體陰性對照組(NC-A549)細胞株。2、HDAC2基因沉默后EM的作用效果下降,其機制與A549細胞HDAC2序列受沉默有關(guān),EM對A549的效果下降。EM的抗炎、促進A549細胞凋亡為通過上調(diào)HDAC2活性實現(xiàn)。
【圖文】：

組蛋白去乙憸化酶２對人肺腺癌Ａ５４９細胞的作用和調(diào)節(jié)邐博士學位論文逡逑表１－１邋ＨＤＡＣ２ｍＲＮＡ在各組標本中的相對表達量（Ｘ士ｓ）逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＨＤＡＣ２ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋Ｅａｃｈ邋ｇｒｏｕｐ邋（邋ｘ±ｓ）逡逑ｇｒｏｕｐ邐Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ａｍｏｕｎｔ逡逑ｌｕｎｇ邋ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邐０．３４０８士（）？邋１２６９＇逡逑ｐａｒａｔｕｍｏｒｏｕｓ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邐０．４１３５士０．１４８６逡逑＊注：與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（八０．０５）。逡逑

Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１０邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ邋ＲＯＳ邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邐Ｆｉｇｕｒｅ２－ｌｌ邋０．５％ＣＳＥ邋ｇｒｏｕｐ邋ＲＯＳ邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ逡逑ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（邋Ｘ邋１００）邐ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（邋Ｘ邋１００）逡逑５．２邋Ａ５４９細胞兩二醛（ＭＤＡ）的測定結(jié)果逡逑用０．邋５％ＣＳＥ處理Ａ５４９細胞４８ｈ后，與空白對照組Ａ５４９細胞（加相應(yīng)體逡逑積的培養(yǎng)基代替ＣＳＥ）相比，０．邋５％ＣＳＥ處理組的ＭＤＡ升高，差異具有統(tǒng)計學逡逑意義（ｐ＜０．０５）（表邋２－１１）。逡逑表邋２－１１邋２邋組細胞邋ＭＤＡ邋的比較（ｎｎｉｏｌ／ｍｇｐｏｒｔ，邋ｘ邋±邋ｓ邋）逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－１１邋Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔｗｏ邋ｇｒｏｕｐｓ邋ｏｆ邋ＭＤＡ邋（ｎｍｏｌ／ｍｇｐｏｒｔ，，邋ｘ邋±ｓ）逡逑ｇｒｏｕｐ邐ＭＤＡ逡逑對照組邐０．４８３６邋士邋０．０６２１邐：逡逑０．５％ｒＳｌＺ邋組邐０．８１８６土０．０８１４＇逡逑＊注：與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（Ｒ０．０５）。逡逑
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

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本文編號：2571950