【摘要】：研究背景和目的近年來肺癌已成為最常見的惡性腫瘤,人們對肺癌的認識已經(jīng)有了一定的發(fā)展進步,但肺癌相關的死亡率在全世界范圍內呈明顯上升趨勢；由于吸煙和環(huán)境因素的影響,肺腺癌已成為肺癌最重要的病理類型,且成為男性惡性腫瘤的首要死亡原因,肺腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個基因,大多數(shù)肺腺癌患者并非死于腫瘤原發(fā)灶本身,而是死于腫瘤的復發(fā)以及轉移。進一步研究肺腺癌的發(fā)生發(fā)展與轉移的分子機制,探析其預后相關的影響因子,明確潛在的靶點,具有十分重要的臨床意義。目前肺癌的發(fā)生機制尚不清楚,因此對其治療亦缺乏特異性。膽堿激酶是生物體細胞內催化膽堿為磷酸膽堿,最終合成生物膜磷脂雙分子層的主要成分磷脂酰膽堿過程中的第一步關鍵酶。該酶由膽堿激酶a (Choline kinase a,CHKA)和膽堿激酶β (CHKB)兩個基因編碼,二者通過同二聚體或異二聚體的方式形成有活性的膽堿激酶。以往相關學者研究主要關注該酶在脂類代謝中的功能,其中CHKA是將膽堿轉化為磷脂酸膽堿的酶,在人類腫瘤中的作用已經(jīng)被廣泛研究。CHKA作為一種發(fā)揮重要作用的酶,在主要生長因子激活的生長信號通路如Ras信號通路激活以及在一些人類腫瘤細胞和組織中起著重要的激活作用；另外大量關于腫瘤細胞的研究結果提示：CHKA在癌基因介導轉換以及包括肺癌在內的人類腫瘤形成的過程中,扮演著重要的角色。近年來,很多研究顯示CHKA及其催化產(chǎn)物磷酸膽堿在多種腫瘤如乳腺癌、肺癌、肝癌、結腸癌、膀胱癌、前列腺癌及卵巢癌等中呈高表達,并且發(fā)現(xiàn)CHKA的表達水平與乳腺癌、肺癌和膀胱癌患者的臨床預后存在相關性,被認為參與了這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展;基于CHKA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,目前許多研究聚焦于CHKA抑制劑方面的研究,認為其可以促進腫瘤細胞的凋亡,發(fā)揮抗腫瘤作用；一些研究小組還通過各種體內外實驗證實CHKA具有癌基因的功能,這些結果均提示CHKA可能在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。然而,CHKA在肺腺癌中的表達情況如何,是否與肺腺癌患者的臨床預后相關、是否參與肺腺癌的惡性進展過程,目前國內外尚未見有系統(tǒng)研究。上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal Transition, EMT)最早在1982年提出,是指在特定的生理和病理情況下上皮細胞通過一系列改變向間充質細胞分化的現(xiàn)象,具體表現(xiàn)為：上皮細胞喪失極性并獲得間質表型、細胞間的連接及黏附能力下降或消失、細胞遷移和轉移侵襲能力增加、細胞形態(tài)改變、以及細胞標志物表達水平的變化,如連環(huán)素(β-catenin)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)等上皮細胞標志物表達下調,波形蛋白(vimentin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)等間質表型標志物表達增加等。EMT在胚胎發(fā)育、組織發(fā)生中發(fā)揮著重要作用,并存在于多種慢性疾病的發(fā)病過程和腫瘤的浸潤轉移過程中。調控細胞EMT發(fā)生的分子機制比較復雜,而且涉及多條細胞信號轉導通路。目前已報道的細胞信號轉導通路主要有TGF-β通路、PI3-K/Akt通路、Wnt/β-catenin通路、Src通路以及整合素通路等。根據(jù)目前研究觀點認為,EMT對于各種癌癥具有積極的預后預測作用,其與侵入性表型和轉移行為能力呈高度相關。大量研究表明“EMT表型”是決定肺癌預后的主要因素,在非小細胞肺癌,EMT表型與表皮生長因子受體突變和耐藥性的研究中上述觀點已被證實。而進一步的研究發(fā)現(xiàn),對比其他實體腫瘤,對肺癌患者不良預后具有預測作用的循環(huán)腫瘤細胞(CTC)表達上皮標記EpCAM較低,這表明肺癌細胞在轉移的前期已經(jīng)經(jīng)歷了EMT,循環(huán)腫瘤細胞失去上皮細胞特征；而文獻報道,CTC中EMT分子分型和數(shù)量是影響肺癌微轉移的重要指征,對肺癌患者的預后和治療具有重要的指導意義。盡管越來越多的證據(jù)表明EMT實際是存在于腫瘤轉移的動態(tài)的過程中,但是誘發(fā)EMT并調控相關通路的關鍵基因及其作用機制尚不明確,有待于進一步研究加以闡明。近年來,不少研究結果顯示膽堿激酶及其催化產(chǎn)物磷酸膽堿在包括乳腺癌、肺癌、結腸癌、膀胱癌、前列腺癌以及卵巢癌在內的多種腫瘤中呈高表達,而且發(fā)現(xiàn)CHKA的表達水平與乳腺癌、肝癌和膀胱癌患者的臨床預后存在相關性；實驗證實CHKA具有癌基因特性,并參與到惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展之中,影響疾病預后。然而CHKA在肺癌中表達情況如何、是否參與肺癌的惡性進展過程,以及CHKA的表達與肺腺癌臨床病理特性之間的關系尚不清楚。作為一種重要的原癌基因,CHKA在肺腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用以及與肺腺癌的預后關系尚無報道,且CHKA是否影響肺上皮細胞的上皮間質轉化也從未被探討。本研究主要聚焦于CHKA在肺腺癌中的表達及其臨床轉化意義,并進一步探討其介導肺癌不良預后的生物學作用和相關分子機制。第一部分CHKA表達對肺腺癌預后預測作用的臨床研究研究背景和目的肺癌已成為全球最常見的惡性腫瘤,嚴重威脅人類的生命健康,其發(fā)病率和死亡率居高不下,這與肺癌的發(fā)病機制不清、缺乏有效的早期診斷和預防手段有關。大多數(shù)肺癌患者并非死于腫瘤原發(fā)灶,而是死于腫瘤的復發(fā)以及轉移。因此,深入研究肺癌發(fā)生發(fā)展與轉移的分子機制,探討其預后相關的影響因子,明確潛在的靶點,對肺癌的防治具有重要的臨床意義。Choline kinase a (CHKA)是一種將膽堿轉化為磷脂酸膽堿的酶,近年來其在人類腫瘤中的作用引起了研究者的關注,CHKA在癌基因介導轉換以及在肺癌等多種人類腫瘤形成的過程中均扮演了重要的角色。截止目前研究,CHKA在肺腺癌中的表達及其與臨床病理特征之間的關系尚不清楚。本研究旨在通過檢測CHKA在肺癌組織樣本中的表達情況,分析其與肺腺癌患者臨床病理特征之間的關系,探討CHKA表達與患者生存時間的相關性,及其在肺腺癌發(fā)生發(fā)展及轉移中的作用,為進一步探索其中的分子機制打下扎實的理論和實驗基礎。研究方法1.分別應用免疫組織化學、RT-PCR、Western Blot方法檢測肺腺癌組織及相應癌旁組織樣品中CHKA的表達情況；2.運用統(tǒng)計學方法分析CHKA的表達與患者的臨床病理特征、預后資料和生存期的相關性。研究結果1.肺腺癌組織中CHKA基因拷貝數(shù)、mRNA的表達均明顯高于癌旁組織；2.肺腺癌組織中CHKA蛋白呈普遍高表達,明顯高于癌旁組織；3.肺腺癌組織中CHKA的高表達與腫瘤微血管侵犯、分期和分化狀態(tài)及低生存時間有關。結論1.肺腺癌組織中CHKA表達增加；2.CHKA的高表達與肺腺癌患者不良預后密切相關；3. CHKA表達增加與患者的一些臨床病理特性,如腫瘤直徑、分期和分化狀態(tài)具有相關性；4.高表達CHKA的患者總體生存時間短,且腫瘤復發(fā)較早；5.CHKA有望成為肺腺癌患者預后預測作用的分子標記物。第二部分CHKA表達對肺腺癌預后預測作用的機制研究研究背景和目的尋找早期診斷和預后判斷指標是肺腺癌基礎和臨床研究中亟待解決的重大問題,也是防治肺腺癌必須針對性研究的主要環(huán)節(jié)。進一步深入探討在肺腺癌發(fā)生發(fā)展與轉移過程中起重要作用基因的分子機制,對肺腺癌早期診治的轉化研究具有重要的意義。研究顯示,Choline kinase α (CHKA)可以誘導人體內正常細胞轉換形成腫瘤細胞,CHKA特異性抑制劑已被證明具有體外抗增殖和體內抗腫瘤活性作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn),CHKA有望成為肺腺癌患者預后預測作用的分子標記物,但其作用的分子機制尚不明確。上皮-間質轉化(Epithelial to Mesenchymal Transition, EMT)是一個細胞表型轉化的過程,在此過程中細胞由極性上皮細胞表型轉化為間質表型,細胞粘附力降低,遷移和侵襲能力增加。本研究旨在體外水平上,觀察CHKA在肺腺癌細胞發(fā)生EMT中的作用及其對肺腺癌細胞遷移與侵襲中的作用,并進一步探究CHKA表達對肺腺癌預后預測作用的分子機制。研究方法1.應用RT-PCR、Western Blot檢測肺腺癌細胞中CHKA的表達情況；2.利用慢病毒感染的方法建立干擾CHKA的肺腺癌細胞系及其對照細胞系；3.對短發(fā)夾CHKA (short hairpin CHKA, shCHKA)及其對照細胞系分別采用增殖實驗、穿膜實驗和侵襲實驗等方法觀察干擾CHKA表達后對肺腺癌細胞系侵襲和轉移能力等生物學行為的影響。研究結果1.過表達CHKA能促進肺腺癌細胞的遷移與侵襲能力；2.過表達CHKA可使肺腺癌細胞發(fā)生EMT轉化；3.干擾CHKA則能有效抑制肺腺癌細胞的遷移與侵襲能力；4.過表達CHKA激活PI3K/Akt信號通路,干擾CHKA則明顯抑制PI3K/Akt通路；5.抑制PI3K/Akt通路可明顯減輕CHKA介導的促遷移與侵襲能力。結論1.過表達CHKA可使肺腺癌細胞發(fā)生EMT轉化,促進肺腺癌細胞發(fā)生遷移與侵襲；2. CHKA促進肺腺癌細胞遷移與侵襲的效應可能主要是通過PI3K/Akt信號通路所介導的；3.本研究揭示了一種新的肺腺癌分子標記物,CHKA有望成為肺腺癌患者預后預測的分子標記物和治療靶點。
【圖文】：

中明思比相應的癌旁組織高。而對患者組織芯片行uQＫＡ免疫組化實驗同樣得到一逡逑致性的結論。逡逑本研究結果發(fā)現(xiàn)，，肺腺癌姐織中}0ＫＡ表達較癌旁組織顯著增加（圖１Ａ和逡逑１Ｂ），實時ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ分析驗證／這個結果（圖１Ｃ和１Ｄ）。逡逑Ｆｉｇｕ邋巧邋１逡逑R誛祀…… 逡逑Ｂ邐Ｄ逡逑ｓ，．邋Ｉ邋＊邋ｉ邋Ｉ邋下邋Ｉ邐ｃｗＡ邋■誦W 逡逑ｓ邋Ｉ邐Ｉ邐廠邐—邐＇邐—＇逡逑ｗ邋甲—邐ｗ…Ｈ逡逑Ｕ邐Ｔｕｍｏｒ邋ＰｖｒＭｕｍｅｒ邋Ｔｉｔｍｅｒ邋Ｐｗｔ－ｔｔｉｍｅｒ邋ｌＵｍｏｒ邋ＰｖｆＭｕｍｏ＊逡逑Ｔｕｍｏｒ逡逑圖１免疫組化檢測腫瘤}D織巧片ＣＨＫＡ的表達逡逑圖１Ａ．和固；ＬＢ．免疫姐織化學染色１１９例組織芯片ＣＨＫＡ的表達，進而分析帥腺癌巧巧癌ｍ織靴逡逑２３逡逑

ｉｌｉａ逡逑Ｐｏｏｒ邋ｄｒｆｌｗｅｎｔｔａｔｔｏｎ邋ｗ，■。巧邋ｅｒｖｆｔｂａｔｉｏｎ逡逑圖２邋ｃｍ表達在肺腺癌中臨床意義逡逑圖２Ａ．邋１１９例腫腺癌患者ＣＨＫＡ高表達組（相對表達水平高于中位數(shù)）和低表達組（相對表逡逑達水平低于中位數(shù)）總生存率。圖２Ｂ．邋１１９例肺腺癌患者組織芯片總生存期的多因素分析。逡逑W ２Ｃ．肺腺癌組織高低分化狀態(tài)ＣＨＫＡ表達的比較（＊ｆ＜０．０５）。逡逑２５逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

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1 Wanqing Chen;Rongshou Zheng;Hongmei Zeng;Siwei Zhang;;The incidence and mortality of major cancers in China,2012[J];Chinese Journal of Cancer;2016年08期

2 熊盼盼;劉菲;;上皮間質轉化相關信號通路在肝纖維化中作用的研究進展[J];國際消化病雜志;2016年03期

3 安世民;丁旭蘋;朱亮;;非小細胞肺癌分子分型與信號調控網(wǎng)絡[J];中國新藥雜志;2015年24期

4 謝會君;俞莎莎;張樂樂;宋懷東;鄭翠俠;;中國人群中16個已知肺癌基因突變的綜合性分析[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2015年33期

5 劉賢忠;徐志波;張先元;張麗婷;童衛(wèi)泉;王帥;王璐;陳芳;;貝伐單抗聯(lián)合鉑類治療晚期非小細胞肺癌療效與安全性的Meta分析[J];中國現(xiàn)代應用藥學;2015年11期

6 劉堯;閆曉紅;楊喬;侯杰;周海平;王寶鋒;耿熠;;NSCLC患者EGFR-TKI靶向治療的臨床效果及預后分析[J];臨床和實驗醫(yī)學雜志;2015年21期

7 霍紅;杜琛;;口腔癌患者VHL表達與上皮間質轉化過程的相關性研究[J];中國臨床研究;2015年10期

8 李長洋;郭學峰;;原發(fā)性支氣管肺癌辨證分型探討[J];臨床醫(yī)藥文獻電子雜志;2015年30期

9 肖悅;任春麗;繆李麗;;西妥昔單抗輔助化療治療進展期非小細胞肺癌療效和安全性的Meta分析[J];中國藥房;2015年27期

10 吳海蘭;辛曉峰;;上皮間充質轉化與慢性阻塞性肺疾病的氣道重塑[J];醫(yī)學研究生學報;2015年09期

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2 陳華夏;粉塵螨提取液致敏CXCR3基因敲除小鼠肺部變應性炎癥的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2009年

本文編號：2571480