發(fā)布時間：2020-01-20 20:48

【摘要】：近十年來,胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(gastroentero-pancreaticneuroendocr ineneoplasm,GEP-NEN)發(fā)病呈逐年增加趨勢,其臨床發(fā)病過程隱匿,進(jìn)展緩慢,約三分之二的患者在疾病確診時腫瘤已發(fā)生轉(zhuǎn)移,但5年生存率超過60%,確定GEP-NEN的腫瘤標(biāo)志物及浸潤轉(zhuǎn)移的早期預(yù)警因素極其重要。胰島素樣生長因子ⅡmRNA結(jié)合蛋白3(insuinlike growth factorⅡmRNA binding protein3.IMP3)是胰島素樣生長因子2 mRNA-結(jié)合蛋白(IMPs)中的家庭成員之一,IMPs包括IMP1,IMP2以及IMP3。特別是在人類和小鼠胚胎的早期階段,IMPs可以通過結(jié)合目的mRNA進(jìn)而影響其轉(zhuǎn)運、定位及穩(wěn)定性。IMP3定位于染色體7p11.5,編碼一個長度為4350-bpmRNA表達(dá)。人類和小鼠的胚胎發(fā)生早期,正常生長的上皮,肌肉及胎盤中均可檢測到IMP3,而在成年人正常組織中幾乎檢測不到IMP3。研究表明IMP3在胃癌,結(jié)腸癌和肺腺癌等惡性腫瘤中過表達(dá)。并與腫瘤侵襲性的進(jìn)展相關(guān),這表明IMP3可能在腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。以往研究表明癌胚蛋白IMP3是通過激活I(lǐng)GF2,進(jìn)而IGF2配體激活共同受體-IGF1受體(IGF1R),IGF1R信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過介導(dǎo)細(xì)胞的有絲分裂,抗凋亡及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。IGF1R作為一種細(xì)胞表面受體與酪氨酸激酶結(jié)合,進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)的第二信使途徑如Theras Raf MAPK和PI3K/AKT/mTOR等在內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。近期一項研究表面IMPS基因家族缺失通過下調(diào)CD44 mRNA表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)IV型膠原纖維的降解和并與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合,使細(xì)胞與基質(zhì)間粘附性降低,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。IMP3與上述基因關(guān)系密切,但關(guān)于IMP3對胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的影響目前仍知之甚少。此外,研究表明IMP3與多種腫瘤預(yù)后相關(guān):IMP3與胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌、淋巴瘤等患者術(shù)后預(yù)后密切相關(guān),并且可以作為獨立預(yù)后風(fēng)險因子預(yù)測腫瘤患者預(yù)后。本研究收集胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的臨床及內(nèi)鏡診治資料,并進(jìn)行隨訪,以收集病例中不同增殖能力的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織或組織蠟塊、神經(jīng)內(nèi)分泌癌細(xì)胞株為研究對象,應(yīng)用常規(guī)病理、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、蛋白印跡法(westernblot)、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qrt-pcr)以及transwell小室等方法研究imp3在胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織中的表達(dá)及其與胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤生物學(xué)特性的關(guān)系;觀察imp3在不同增殖能力神經(jīng)內(nèi)分泌瘤及神經(jīng)內(nèi)分泌癌細(xì)胞株中的表達(dá)以及抑制imp3對神經(jīng)內(nèi)分泌癌細(xì)胞株stc-1細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的影響;進(jìn)而通過抑制imp3表達(dá),闡明imp3在神經(jīng)內(nèi)分泌癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用,為神經(jīng)內(nèi)分泌癌病情的綜合評估和分子靶向性治療提供依據(jù)。本研究共分為4個部分:第一部分imp3在不同增殖能力的胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤表達(dá)及臨床預(yù)后分析目的:探討胰島素樣生長因子Ⅱmrna結(jié)合蛋白3(insulin-likegrowthfactorⅡmrnabindingprotein3,imp3)在胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(gep-nen)中的表達(dá)及意義。方法:選取2006年1月至2014年12月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院資料完整、診斷明確的gep-nen患者162例,其中包括神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤g185例,神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤g240例,神經(jīng)內(nèi)分泌癌g328例及混合腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌9例,并記錄其臨床病理特征及隨訪情況,采用免疫組化法檢測imp3、mmp2、igf-1r及cd44的表達(dá),同時對不同增殖分級的腫瘤中imp3及相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)進(jìn)行比較。結(jié)果:imp3陽性表達(dá)率在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中為74.69%。imp3陽性組與陰性組相比生存時間明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.012);imp3的過表達(dá)與腫瘤增殖分級,浸潤深度及腫瘤大小相關(guān)(均p0.05),imp3陽性表達(dá)患者的生存率低于陰性患者(p0.05)。cd44、igf-1r及mmp2在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的表達(dá)率分別為19.75%,53.7%,55.56%,通過cox生存分析發(fā)現(xiàn)imp3過表達(dá)、腫瘤大小,腫瘤增殖分級均與gep-nen預(yù)后相關(guān)。imp3與mmp2及igf-1r表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.288;p0.01andr=0.208;p=0.008),與cd44表達(dá)負(fù)相關(guān)(r=-0.131;p=0.096)。小結(jié):1imp3在神經(jīng)內(nèi)分泌癌g3中表達(dá)高于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤g1及g2組織,其可能參與了gep-nen的發(fā)生進(jìn)展。2imp3表達(dá)陽性gep-nen患者生存率低;imp3可能作為胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的預(yù)后因子。3imp3高表達(dá)與gep-nen腫瘤浸潤及腫瘤大小相關(guān);4imp3與igf-1r及mmp2表達(dá)呈正相關(guān),與細(xì)胞黏附因子cd44無明顯相關(guān)性。第二部分imp3與低增殖活性胃腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤內(nèi)鏡病理特征的關(guān)系目的:探討胰島素樣生長因子Ⅱmrna結(jié)合蛋白3(insulin-likegrowthfactorⅡmrnabindingprotein3,imp3)在低增殖活性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織中的表達(dá)及其與內(nèi)鏡病理特征的關(guān)系方法:對內(nèi)鏡診斷及病理證實的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤超聲內(nèi)鏡進(jìn)行病灶評估,選擇可切除病例行鏡下切除,體外測量病灶大小,結(jié)合內(nèi)鏡下表現(xiàn)及臨床資料進(jìn)行分析隨訪,收集其中18例神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者內(nèi)鏡切除標(biāo)本及3例活檢標(biāo)本。所有標(biāo)本均在手術(shù)切除后放入無菌ep管中,并迅速置于液氮中轉(zhuǎn)運至80℃冰箱保存?zhèn)溆�。所有患者術(shù)前均未接受放、化療,術(shù)后均經(jīng)病理檢查證實免疫組化確診為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。采用western-blot法,檢測21例神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者癌組織。結(jié)果:1超聲胃鏡與術(shù)后病理對比觀察:21例患者均經(jīng)超聲內(nèi)鏡檢查明確病變深度,其中18例接受鏡下切除治療,18例患者超聲胃鏡判斷深度與術(shù)后病理對照發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)確性88.9%(16/18),超聲胃鏡對net浸潤深度判斷具有較高的準(zhǔn)確性。2內(nèi)鏡切除療效及隨訪:18例切除患者隨訪12-24個月,無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,對較小的(直徑小于1cm)、分化程度較好的g1或g2期胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤在超聲內(nèi)鏡指導(dǎo)下選擇合適的內(nèi)鏡切除方法安全有效。3imp3蛋白表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系:低增殖活性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織內(nèi)imp3蛋白表達(dá)采用westem-blot法,檢測21例低增殖活性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者組織內(nèi)imp3蛋白表達(dá)陽性。結(jié)果顯示,低增殖活性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織內(nèi)imp3蛋白表達(dá)量在增殖分級、腫瘤大小及浸潤深度分組中表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義(1.4176±0.1168vs0.8187±0.3169,p0.001;1.3806±0.1286vs0.8372±0.3491,p0.05;1.3801±0.1268vs0.7470±0.2814,p0.05),而在年齡、性別、腫瘤個數(shù)及腫瘤發(fā)生部位等分組中無明顯差異。小結(jié):1小于等于1cm的低增殖活性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤內(nèi)鏡微創(chuàng)治療安全有效;2imp3蛋白在低增殖活性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中g(shù)2期imp3表達(dá)陽性率明顯高于g1期患者;3低增殖活性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織內(nèi)imp3蛋白表達(dá)量與腫瘤大小及浸潤深度相關(guān)。第三部分 imp3對小腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞增殖侵襲遷移生物學(xué)特性的影響目的:探討sirna抑制胰島素樣生長因子Ⅱmrna結(jié)合蛋白3(imp3))基因表達(dá)對小鼠神經(jīng)內(nèi)分泌癌stc-1細(xì)胞增殖侵襲遷移活性的影響。方法:構(gòu)建針對imp3的sirna序列3條,非特異性sirna序列1條,篩選鑒定效果最佳的imp3-sirna;應(yīng)用imp3-sirna轉(zhuǎn)染小鼠神經(jīng)內(nèi)分泌癌細(xì)胞株stc-1;免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察細(xì)胞中蛋白表達(dá)情況;mtt法檢測細(xì)胞生長曲線;brdu法檢測細(xì)胞dna合成能力,通過transwell小室模型分析imp3對stc-1細(xì)胞遷移和侵襲的影響。結(jié)果:成功構(gòu)建imp3-sirna轉(zhuǎn)染體系,imp3-sirna-1轉(zhuǎn)染stc-1細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示,與con組及ns-sirna組相比,imp3-sirna組細(xì)胞株imp3的染色較淺,mtt實驗及brdu法摻入實驗發(fā)現(xiàn),與con組及ns-sirna組相比,imp3-sirna組dna合成能力減弱,細(xì)胞增殖能力明顯降低;transwell小室模型分析發(fā)現(xiàn)與con組及ns-sirna組相比,imp3-sirna組的細(xì)胞遷移及跨膜侵襲能力均受到明顯抑制(p0.05)。小結(jié):1成功構(gòu)建imp3-sirna序列3條,其中imp3-sirna-1轉(zhuǎn)染效率最高,抑制imp3效果最好;2抑制imp3表達(dá)后stc-1細(xì)胞增殖活性降低;3抑制imp3表達(dá)后stc-1細(xì)胞跨膜遷移活性及細(xì)胞遷移率均受到明顯抑制;第四部分 imp3對小腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞增殖侵襲遷移影響的作用機(jī)制目的:探討sirna抑制胰島素樣生長因子Ⅱmrna結(jié)合蛋白3(imp3))基因表達(dá)對小鼠神經(jīng)內(nèi)分泌癌stc-1細(xì)胞增殖侵襲遷移活性影響的作用機(jī)制。方法:選取第三部分中沉默效果最佳的一條imp3-sirna-1;應(yīng)用imp3-sirna轉(zhuǎn)染小鼠神經(jīng)內(nèi)分泌癌細(xì)胞株stc-1;westernblot檢測干擾imp3蛋白表達(dá)后并檢測ns-sirna組腫瘤凋亡增殖生長(p27,cyclindl,egfr和ki67)、侵襲轉(zhuǎn)移(igf1r,vegfa,mmp9,mmp2)等相關(guān)指標(biāo)的變化結(jié)果:imp3-sirna-1轉(zhuǎn)染stc-1細(xì)胞,與con組及ns-sirna組相比,imp3-sirna組腫瘤凋亡增殖蛋白,egfr和ki67蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào),而cyclindl、p27蛋白表達(dá)未見明顯變化;與con組及ns-sirna組相比,imp3-sirna組侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白igf1r,vegfa,mmp2,mmp9蛋白表達(dá)減低。小結(jié):1imp3沉默可能通過下調(diào)與腫瘤增殖生長相關(guān)的蛋白egfr和ki67的表達(dá)來抑制神經(jīng)內(nèi)分泌癌細(xì)胞的增殖。2imp3沉默可能通過igf1r信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下調(diào)vegfa、基質(zhì)金屬蛋白酶mmp2、mmp9等相關(guān)蛋白,進(jìn)而影響神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移,促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。結(jié)論:1imp3表達(dá)與胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的生物學(xué)特性相關(guān);其在gep-nen組織中陽性表達(dá)率較高;在神經(jīng)內(nèi)分泌癌g3及manec組織中表達(dá)高于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤g1、g2組織;其可能參與了gep-nen的發(fā)生進(jìn)展。imp3表達(dá)陽性gep-nen患者生存率低,imp3可能作為胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的預(yù)后因子。2超聲內(nèi)鏡評估胃腸低增殖活性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤準(zhǔn)確性高,并可以指導(dǎo)內(nèi)鏡切除方式;小于等于1cm的胃腸低增殖活性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤內(nèi)鏡微創(chuàng)治療安全有效。在低增殖活性的胃腸低增殖活性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中imp3表達(dá)存在差異,腫瘤大小及浸潤深度不同imp3表達(dá)同樣存在差異,IMP3蛋白可能成為低增殖活性胃腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的內(nèi)鏡診療效果及預(yù)后評價的指標(biāo)。3成功構(gòu)建IMP3-siRNA序列3條,其IMP3-siRNA-1轉(zhuǎn)染效率最高,抑制IMP3效果最好;抑制IMP3表達(dá)后STC-1細(xì)胞活性降低、細(xì)胞增殖受到抑制;細(xì)胞遷移活性降低;細(xì)胞跨膜侵襲率均受到明顯抑制4抑制IMP3表達(dá)后;可能通過下調(diào)與腫瘤增殖生長相關(guān)的蛋白EGFR和ki67的表達(dá)來抑制神經(jīng)內(nèi)分泌癌細(xì)胞細(xì)胞的增殖。調(diào)節(jié)其下游的IGF1R信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下調(diào)VEGFA的表達(dá),減少基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP9分泌,進(jìn)而影響神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移,促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。5 IMP3可能是胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的一個重要分子靶點,通過抑制IMP3表達(dá)可能發(fā)揮抗胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的作用。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2571369