【摘要】：目的前列腺癌是歐美國家常見的男性腫瘤,死亡率僅次于肺癌,近年來由于西化生活方式的影響,前列腺癌的發(fā)病率在亞洲國家呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢,且發(fā)現(xiàn)時大多處于晚期,內(nèi)分泌治療為患者提供了一定的生存期,但是僅能提供大約20個月的無進展生存期,后期逐漸發(fā)展為去勢抵抗前列腺癌Castration resistant prostate cancer,CRPC),主要表現(xiàn)為癌細胞在緩解期后又開始增殖,PSA持續(xù)性增高,極易發(fā)生骨轉移,許多患者最終死于腫瘤復發(fā)和轉移。前列腺癌由激素依賴向激素非依賴的轉變機制目前尚不明確,但隨著研究的進展已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多條與激素非依賴轉變相關的信號通路,如在激素非依賴階段血PSA持續(xù)性增高,提示了雄激素受體(Androgen receptor, AR)信號通路并未被阻斷,其在去勢抵抗性前列腺癌(Castration resistant prostate cancer, CRPC)發(fā)生發(fā)展中持續(xù)發(fā)揮作用。其機制主要包括雄激素受體基因的突變、擴增、AR信號通路傳導異常等,以及近年來的研究熱點腫瘤干細胞,這類細胞具有強大的自我更新、多向分化和高度耐藥及轉移潛能,被認為是腫瘤復發(fā)和轉移的根源,且已有研究證明前列腺癌干細胞與PCa的耐藥具有相關性。但更重要的是前列腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟多因素的過程,涉及到細胞內(nèi)的一系列復雜的變化。因此研發(fā)相對低毒高效的腫瘤靶向藥物,探索能夠特異性協(xié)同抑制前列腺細胞的藥物組合并揭示其協(xié)同作用機制成為臨床上亟待解決的問題,具有重要的理論意義和應用價值。MUC1是單通道I型跨膜蛋白,擁有重度糖基化的胞外區(qū)域,從細胞表面延伸200-500 nm,正常多分布在腺上皮或者腔管上皮細胞,如乳腺、食道、胃、十二指腸、胰腺、子宮、前列腺和肺,小部分分布在造血細胞,皮膚和間充質細胞沒有MUC1的表達。在正常組織中,細胞表面MUC1帶負電荷的糖鏈形成物理屏障并能發(fā)揮粘附和抗粘附雙重作用以減輕免疫應答,且糖鏈可寡聚化形成黏液膠潤滑基底上皮細胞,防止因PH值改變、污染物污染和微生物侵襲造成的傷害,除了正常的生理作用以外,在許多類型的癌癥,如乳腺癌、結腸癌、肺癌、胃癌、胰腺癌中,異常糖基化的MUC1常呈現(xiàn)過表達的趨勢,因此被作為一種致瘤因子受到廣泛的關注。研究表明MUC1可以調(diào)節(jié)結締組織生長因子、血小板源性生長因子A和血小板源性生長因子B并激活MAPK和PI3K/Akt信號通路,從而促進腫瘤細胞的增殖和生存。異常的糖代謝是癌癥的一個重要特征,用來維持腫瘤細胞旺盛的新陳代謝,HIF-lα可以調(diào)節(jié)糖酵解過程中關鍵酶的表達,MUCl作為調(diào)節(jié)器又可以調(diào)節(jié)HIF-lα的表達、穩(wěn)定性和活性,并與HIF-lα形成復合物結合到糖酵解相關基因啟動子上促進基因的表達和轉錄。此外MUCl還可以促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。侵襲作為腫瘤轉移的前提和先決條件,它使細胞從基底膜分離,降解周圍基質最終侵犯周圍組織或進入血液。在對前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)激素非依賴前列腺癌細胞DU145和PC3細胞相對于正常的前列腺上皮細胞PrEC MUC1表達明顯增多,而激素依賴前列腺癌細胞LNCaP MUC1表達缺失,在前列腺癌細胞中MUC1-C (MUClC端亞基)亦能抑制AR受體的表達,使其轉變?yōu)楦哂星忠u力的雄激素非依賴表型并依賴MUCl-C生存,因此本課題我們將MUC1作為關鍵的目的蛋白進行研究,探討前列腺癌由激素依賴向激素非依賴轉變的機制及前列腺癌激素非依賴階段的治療。我國中藥資源豐富,且藥理作用廣泛,毒副作用小,越來越多的中藥被證明其活性成分具有抗腫瘤作用,并被廣泛應用于臨床。因此,以MUC1為作用靶點,為前列腺癌激素非依賴階段尋找新的抗腫瘤成分,具有一定的社會意義。澳洲茄邊堿(solamargine, SM)是中藥龍葵主要活性成分之一,是一種天然甾體生物堿糖苷化合物和細胞毒性劑,能引起腫瘤細胞的凋亡或與其他化學藥物起到協(xié)同作用,增強治療效果,有研究表明澳洲茄邊堿能增強肺癌細胞對TNFs的敏感性,課題組前期研究也表明澳洲茄邊堿能通過stat3信號通路抑制肺癌細胞生長并引起肺癌細胞凋亡,但澳洲茄邊堿對于去勢抵抗性前列腺癌的作用未見報道。研究發(fā)現(xiàn)SM可以激活AMPKα,且流行病學研究表明,AMPKα的激動劑二甲雙胍可以降低乳腺癌,結腸癌、胰腺癌、和肝癌癥的發(fā)生風險,甚至可能改善癌癥的預后。結合國內(nèi)外研究,我們初步推斷二甲雙胍和SM可能具有一定的疊加作用。本研究采用激素非依賴前列腺癌細胞株DU145和PC3為體外模型,探討澳洲茄邊堿聯(lián)合二甲雙胍對激素非依賴前列腺癌細胞生長的抑制作用及其可能的分子機制,并用裸鼠建立體外移植瘤模型,驗證澳洲茄邊堿的體內(nèi)抗腫瘤活性。方法1.MTT檢測SM抑制DU145和PC3細胞活力的效應和時間劑量關系,流式細胞術檢測SM對PC3細胞周期的影響,western-blot、RT-PCR和啟動子活性檢測與此有關信號通路關鍵蛋白的變化,并使用相關激酶抑制劑和過表達質粒以改變關鍵蛋白的活化狀態(tài),觀察上下游信號和細胞生長抑制效應的改變。明確相關信號通路與SM引起的增殖抑制效應的關系,明確其分子機制。2、設立空白對照組,劑量依次增加的SM組,作用DU145和PC3細胞,MTT和流式細胞術檢測SM對細胞生長和細胞周期的影響以及是否具有時間和劑量關系,western-blot、RT-PCR等檢測相關通路蛋白的表達變化,并干預其活化狀態(tài),明確SM發(fā)揮作用的信號通路。3、SM聯(lián)合Metformin,分為空白對照組、SM組、metformin組和SM+metformin組,MTT檢測Metformin是否能增強SM抑制細胞增殖的效應,western-blot、RT-PCR等檢測Metformin是否能增強SM對相關通路蛋白的影響。4、建立裸鼠荷瘤模型,通過皮下注射的方法,分別設立空白對照組,SM低劑量組(5mg/kg)和SM高劑量組(10mg/kg),對照組注射等量PBS,觀察各組腫瘤的大小和重量差異以及有無轉移瘤等,明確SM體內(nèi)抗腫瘤活性。結果1.SM能抑制DU145和PC3細胞生長,并能將PC3細胞阻滯在G0/G1期:6μmol/LSM作用24 h后DU145和PC3細胞活力分別下降為(49.20±4.66)%、(56.28±2.36)%并具有時間和劑量依賴P＜0.05),10μmol/LSM作用24 h后細胞活力分別為(25.71±2.56)%、(32.07±2.53)%,(p0.05)。流式細胞術顯示不同濃度SM(0、4、6、8μmol/L)處理PC3細胞能引起PC3細胞阻滯在G1期,G1期細胞比例分別為(52.61±0.50)%、(52.96±1.49)%、(66.16±2.84)%和(69.03±2.38)%,后兩者具與對照組比較具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。2.SM能激活AMPKα/NF-kB/MUC1信號通路：不同濃度SM(0、1、2、4、6、8μmol/L)處理DU145和PC3細胞,結果發(fā)現(xiàn)蛋白MUC1表達下調(diào),轉錄因子p65亦下調(diào),且過表達MUC1可以促進細胞的增殖,在基因水平上SM能下調(diào)MUCl mRNA的表達和啟動子的活性,在對其上游信號通路的研究中發(fā)現(xiàn)其能激活AMPK α,且AMPK α抑制劑Compound C能逆轉由SM引起的MUC1及p65下調(diào)。3.二甲雙胍可以增強SM的生物效應：二甲雙胍聯(lián)合SM相比單獨SM處理組,p65、MUC1下調(diào)更明顯,且AMPK α的磷酸化水平亦比單獨SM處理組明顯升高。4.SM能抑制體內(nèi)腫瘤的生長：體內(nèi)實驗證明SM腹腔注射能有效抑制體內(nèi)腫瘤的生長,高劑量組與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結果說明SM在體內(nèi)具有抗腫瘤活性。結論：1.澳洲茄邊堿可以抑制前列腺癌激素非依賴細胞DU145和PC3的生長并可引起PC3細胞周期阻滯。2.澳洲茄邊堿可以通過激活AMPK α抑制下游NF-kB/MUCl信號通路,從而抑制細胞細胞生長。3.澳洲茄邊堿聯(lián)合二甲雙胍在抑制前列腺癌激素非依賴細胞生長過程中具有疊加效應。4.澳洲茄邊堿可以抑制裸鼠體外移植瘤的生長,作用機制與AMPK α的激活并抑制下游NF-kB/MUCl信號通路有關。綜上所述我們認為澳洲茄邊堿體外能夠抑制DU145和PC3細胞生長,體內(nèi)可以調(diào)控腫瘤生長,并證明其作用的發(fā)揮與AMPKα的激活以及下游NF-kB/MUCl信號通路有關,且二甲雙胍可以增強澳洲茄邊堿的藥效。我們的工作進一步完善了對澳洲茄邊堿生物活性的認識,為去勢抵抗性前列腺癌的治療提供了新的靶點,并為臨床輔助用藥提供了參考。
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25

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本文編號：2571233