【摘要】：背景:慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia,CML)是來源于多能造血干細(xì)胞的一種惡性增殖性疾病,具有高度增生和惡性侵襲的生物學(xué)特性。約占成年人白血病的20%。大部分CML患者都會(huì)出現(xiàn)Ph染色體的特異細(xì)胞遺傳學(xué)改變,即9號(hào)染色體長(zhǎng)臂上ABL原癌基因易位至22號(hào)染色體長(zhǎng)臂的斷裂點(diǎn)簇集區(qū)(BCR)形成BCR-ABL融合基因。該蛋白具有持續(xù)激活酪氨酸激酶活性,BCR-ABL酪氨酸激酶可激活下游信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞持續(xù)增殖、增強(qiáng)細(xì)胞遷移、影響細(xì)胞正常凋亡、阻斷細(xì)胞分化,引起CML。miR-4521異常表達(dá)與多種癌癥密切相關(guān)。FAM129A高表達(dá)與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān),FAM129A下調(diào)能夠抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖,遷移,侵襲及凋亡。但二者在CML進(jìn)展及K562細(xì)胞惡性行為的研究尚無報(bào)道。目的:1.研究CML患者骨髓樣本中miR-4521,FAM129A表達(dá)及二者相關(guān)性;2.探討miR-4521與FAM129A間靶向負(fù)調(diào)控關(guān)系;3.研究miR-4521上調(diào)對(duì)K562生物學(xué)行為影響及分子機(jī)制;4.研究FAM129A下調(diào)對(duì)K562生物學(xué)行為影響及分子機(jī)制;方法:1.qRT-PCR法檢測(cè)miR-4521,FAM129A在33例人初發(fā)CML樣本,6例正常人樣本,及7例非惡性白血病樣本中表達(dá)情況,比較CML病人在初發(fā)及完全緩解(CR)情況下,miR-4521,FAM129A水平變化及相互間關(guān)系。2.通過miRNA預(yù)測(cè)軟件(TargetScan,miRDB)分析miR-4521與FAM129A間靶向關(guān)系;psi-CHECKTM2.0-WT-FAM129A-3'UTR/psi-CHECKTM2.0-MUT-FAM129A-3'UTR表達(dá)載體構(gòu)建;將重組雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體分別與miR-4521 mimic/NC mimic共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中,檢測(cè)雙熒光素酶的活性值,驗(yàn)證靶向關(guān)系;3.利用LipofetaminTM 2000轉(zhuǎn)染試劑,將miR-4521 mimic瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至K562中,qRT-PCR法檢測(cè)miR-4521上調(diào)效率及FAM129A表達(dá);WB法檢測(cè)miR-4521上調(diào)對(duì)FAM129A表達(dá)影響;臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法檢測(cè)miR-4521上調(diào)對(duì)K562增殖影響;Transwell小室法檢測(cè)miR-4521上調(diào)對(duì)K562遷移,侵襲能力影響;qRT-PCR法檢測(cè)miR-4521上調(diào)后,MMP-2,MMP-9,TIMP-1表達(dá);4.利用LipofetaminTM 2000轉(zhuǎn)染試劑,將si-FAM129A瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至K562中,用WB法檢測(cè)FAM129A下調(diào)效率;臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法檢測(cè)FAM129A下調(diào)對(duì)K562增殖影響;Transwell小室法檢測(cè)FAM129A下調(diào)對(duì)K562遷移,侵襲能力影響,qRT-PCR法檢測(cè)FAM129A下調(diào)后,MMP-2,MMP-9,TIMP-1表達(dá);結(jié)果:1.與正常樣本組相比,miR-4521呈現(xiàn)低表達(dá),FAM129A呈現(xiàn)高表達(dá),miR-4521,FAM129A在非惡性樣本中表達(dá)無差異;在同一患者樣本中,與初發(fā)CML樣本相比,二者表達(dá)水平在CR階段都出現(xiàn)“回復(fù)”現(xiàn)象;初發(fā)CML樣本中,miR-4521與FAM129A間表達(dá)水平負(fù)相關(guān)(P=0.0152,R2=0.2218);2.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明,在MUT組中,NCmimic組與miR-4521mimic組的檢測(cè)活性無明顯差異,但WT組中,二者檢測(cè)活性差異明顯,與NC mimic相比,miR-4521mimic組的檢測(cè)活性降低44%,P=0.0022;3.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-4521 mimic后,K562增殖,遷移和侵襲能力均受到抑制,FAM129A基因和蛋白表達(dá)分別降低57.1%及蛋白水平降低41%,MMP-2,MMP-9基因表達(dá)均降低,TIMP-1表達(dá)升高;4.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染si-FAM129A后,K562增殖,遷移和侵襲能力均受到抑制,MMP-2,MMP-9基因表達(dá)降低,TIMP-1表達(dá)升高。結(jié)論:1.miR-4521低表達(dá),FAM129A高表達(dá)與CML發(fā)病正相關(guān),CML病人治療CR后,二者表達(dá)水平逆轉(zhuǎn)回復(fù);CML患者骨髓樣本中,miR-4521和FAM129A水平顯著負(fù)相關(guān);2.miR-4521通過結(jié)合FAM129A 3'UTR區(qū)靶向負(fù)調(diào)控FAM129A表達(dá);3.miR-4521上調(diào)能夠明顯抑制K562增殖,遷移,侵襲能力,降低MMP-2,MMP-9及升高TIMP-1表達(dá);4.FAM129A下調(diào)能夠明顯抑制K562增殖,遷移,侵襲能力,降低MMP-2,MMP-9及升高TIMP-1表達(dá);總之,miR-4521通過靶向負(fù)調(diào)控FAM129A表達(dá),影響MMP-2,MMP-9,TIMP-1表達(dá),進(jìn)而影響K562細(xì)胞增殖,遷移,侵襲,以此影響CML發(fā)生,發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R733.72

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2571179