【摘要】：慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是基于多能干細(xì)胞水平上的惡性疾病,特點(diǎn)是具有獲得性的異常的染色體,是一種造血干細(xì)胞惡性疾病,以骨髓及外周血中粒細(xì)胞的無(wú)限增殖為主要特征。特異性的細(xì)胞遺傳學(xué)變化在大約95%的慢性粒細(xì)胞白血病患者中都有發(fā)生,具體表現(xiàn)為9號(hào)和22號(hào)染色體發(fā)生易位,導(dǎo)致形成費(fèi)城染色體(Ph染色體),并且產(chǎn)生BCR/ABL融合基因,其對(duì)應(yīng)的融合蛋白具有可以異常升高酪氨酸蛋白激酶活性的特點(diǎn),此融合蛋白可以催化并且磷酸化多種底物蛋白酪氨酸殘基,繼而激活多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑,促進(jìn)細(xì)胞增殖,減少細(xì)胞凋亡。目前,在慢性粒細(xì)胞白血病的治療中,酪氨酸激酶抑制劑被廣泛應(yīng)用并且取得了很好的療效。但是,臨床上對(duì)該藥物的耐藥越來(lái)越明顯,研究并探索其他的治療方法已經(jīng)成為白血病治療過(guò)程中急需解決的問(wèn)題。唾液酸轉(zhuǎn)移酶在腫瘤細(xì)胞中的調(diào)節(jié)作用最近被廣泛的關(guān)注。而且,有許多世界各地的學(xué)者已經(jīng)致力于研究多糖的變化與惡性腫瘤化療耐藥之間的關(guān)系,細(xì)胞膜上糖蛋白糖鏈的變化己經(jīng)被確定了與白血病的耐藥相關(guān)。然而,唾液酸轉(zhuǎn)移酶在腫瘤的多藥耐藥中的作用尚未被完全了解。MicroRNA是一個(gè)大小約為22-25個(gè)堿基的微小分子,由于其具有著復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)以及對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為具有多方面的影響,因此microRNA已經(jīng)成為當(dāng)前世界醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的新前沿?zé)狳c(diǎn)。MicroRNA與腫瘤疾病包括白血病之間的密切聯(lián)系已經(jīng)為人們所了解。然而,microRNA以某種唾液酸轉(zhuǎn)移酶為靶點(diǎn)對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病多藥耐藥性的調(diào)節(jié)作用尚未被知曉。本實(shí)驗(yàn)對(duì)ST3GAL家族和ST6GALNAC家族在慢性粒細(xì)胞白血病多藥耐藥中的作用進(jìn)行研究,同時(shí)研究microRNA在慢性粒細(xì)胞白血病多藥耐藥中所具有的調(diào)節(jié)作用。目的：通過(guò)研究ST3GAL和ST6GALNAC家族在三對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株及慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的差異表達(dá),明確ST3GAL和ST6GALNAC家族與人慢性粒細(xì)胞白血病多藥耐藥的相關(guān)性,并且研究miR-4701-5p以ST3GAL1作為靶點(diǎn)和miR-4299以ST6GALNAC4為靶點(diǎn)對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病多藥耐藥的影響,從而為預(yù)測(cè)和診斷慢性粒細(xì)胞白血病多藥耐藥性,尋求逆轉(zhuǎn)藥物提供新策略和靶點(diǎn)。方法：(1)采用real-time PCR技術(shù)和western-blot技術(shù)檢測(cè)三對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株及慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的ST3GAL和ST6GALNAC家族的表達(dá)情況,篩選出具有差異表達(dá)ST基因。(2)特異性下調(diào)、上調(diào)差異表達(dá)的ST3GAL1基因和ST6GALNAC4基因,檢測(cè)干擾、過(guò)表達(dá)前后KCL22/ADR、KCL22細(xì)胞在體內(nèi)、體外對(duì)化療藥物敏感性的變化。(3)采用real-time PCR檢測(cè)三對(duì)化學(xué)敏感和化學(xué)耐藥的人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株和臨床慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-4701-5p和miR-4299的表達(dá)變化。miR-4701-5p的模擬物(100nM)轉(zhuǎn)染到KCL22細(xì)胞中,將miR-4701-5p的拮抗劑轉(zhuǎn)染到KCL22/ADR細(xì)胞中,然后檢測(cè)ST3GAL1表達(dá)的變化。將miR-4299的模擬物(100nM)轉(zhuǎn)染到KCL22/ADR細(xì)胞中,將miR-4299的拮抗劑轉(zhuǎn)染到KCL22細(xì)胞中,然后對(duì)ST6GALNAC4表達(dá)的變化進(jìn)行檢測(cè)。將ST3GAL1和ST6GALNAC4的3’-UTR的靶基因序列(wt 3’-UTR)和ST3GAL1和ST6GALNAC4的突變基因序列(mt 3’-UTR)克隆到熒光素酶報(bào)告基因載體,然后將wt.3'-UTR或mt 3’-UTR載體和miR-4701-5p模擬物轉(zhuǎn)染到KCL22細(xì)胞中以及miR-4299模擬物轉(zhuǎn)染到KCL22/ADR細(xì)胞中,進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。(4)將miR-4701-5p的模擬物轉(zhuǎn)染到KCL22細(xì)胞中,而miR-4701-5p的拮抗劑轉(zhuǎn)染到KCL22/ADR細(xì)胞中,將miR-4299的模擬物轉(zhuǎn)染到KCL22/ADR細(xì)胞中,而miR-4299的拮抗劑轉(zhuǎn)染到KCL22細(xì)胞中,檢測(cè)化學(xué)藥物阿霉素、紫杉醇和長(zhǎng)春新堿的IC50值,用以研究miR-4701-5p和miR-4299是否可以在體外調(diào)節(jié)CML細(xì)胞的藥物敏感性。將轉(zhuǎn)染了,miR-4701-5p的激活劑、,niR-4701-5p的拮抗劑、miR-4299的激活劑、miR-4299的拮抗劑和陰性對(duì)照的KCL22細(xì)胞和KCL22/ADR細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi),測(cè)量小鼠腫瘤體積；qRT-PCR和western blotting方法檢測(cè)腫瘤組織中ST3GAL1、ST6GALNAC4、miR-4701-5p和miR-4299的表達(dá)情況。第一部分結(jié)果：(1) ST3GAL2和ST3GAL3在KCL22、K562和KU812細(xì)胞中的表達(dá)與其阿霉素耐藥細(xì)胞株的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)明顯差異；ST3GAL1和ST3GAL5在三種藥物敏感的親本細(xì)胞株中基因及蛋白的表達(dá)明顯增高(*P0.05)；ST3GAL4在三種耐藥細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)(*P0.05)；而ST3GAL6在三對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株中無(wú)表達(dá)。(2) ST3GAL4在CML/MDR患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中呈高表達(dá)(*P0.05)；ST3GAL1和ST3GAL5在CML組中呈高表達(dá)(*P0.05)；ST3GAL2和ST3GAL3的表達(dá)在兩組中無(wú)明顯差異；ST3GAL6在兩組中表達(dá)量較低。(3)干擾ST3GAL1后的KCL22細(xì)胞株在：mRNA和蛋白水平上的表達(dá)均顯著降低,作用于KCL22-ST3GAL1 shRNAl細(xì)胞的抗腫瘤藥物的IC50值明顯高于對(duì)照組。未經(jīng)阿霉素治療的小鼠在第21天到第28天期間,可以觀察到注射KCL22-ST3GAL1 shRNAl的小鼠平均瘤體積(891士92 mm3)顯著高于shRNA對(duì)照組(585士62 mm3,*P0.05)。在經(jīng)阿霉素治療的小鼠中亦存在相同的現(xiàn)象。(4)特異性上調(diào)ST3GAL1后,作用于KCL22/ADR/ST3GAL1細(xì)胞的抗腫瘤藥物的IC50值明顯低于KCL22/ADR/mock細(xì)胞的IC50值。小鼠在注射KCL22/ADR/ST3GAL1后的平均瘤體積明顯低于注射KCL22/ADR/mock的小鼠。給小鼠注射同樣的KCL22/ADR/ST3GAL1,經(jīng)過(guò)阿霉素治療的小鼠平均瘤體積明顯小于未經(jīng)過(guò)阿霉素治療的小鼠。(5) MiR-4701-5p的表達(dá)量在KCL22、K562和KU812細(xì)胞和慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中顯著下降,而ST3GAL1在化學(xué)敏感細(xì)胞株及藥物敏感患者的細(xì)胞中表達(dá)是升高的。轉(zhuǎn)染了模擬物的KCL22細(xì)胞中ST3GAL1的mRNA及蛋白的表達(dá)量明顯下降,在轉(zhuǎn)染了miR-4701-5p拮抗劑的KCL22/ADR細(xì)胞中,ST3GAL1的mRNA及蛋白的表達(dá)量明顯上升。轉(zhuǎn)染了wt3’-UTR載體的KCL22細(xì)胞中miR-4701-5p表達(dá)的熒光素酶活性明顯下降,但是此結(jié)果可以被mt ST3GAL1逆轉(zhuǎn)。(6) MiR-4701-5p的高表達(dá)可顯著抑制KCL22細(xì)胞對(duì)化學(xué)藥物的敏感性,阿霉素、紫杉醇和長(zhǎng)春新堿的IC50值升高。同時(shí),在KCL22/ADR細(xì)胞中miR-4701-5p被拮抗劑所抑制后,可觀察到這三種化療藥物的IC50值下降。轉(zhuǎn)染了miR-4701-5p的小鼠的腫瘤體積在經(jīng)過(guò)阿霉素化療后有明顯的改變,并且通過(guò)改變miR-4701-5p的表達(dá)可以調(diào)節(jié)ST3GAL1 mRNA和蛋白的表達(dá)。第二部分結(jié)果：(1) ST6GALNAC1、ST6GALNAC2和ST6GALNAC6在KCL22.K562和KU812細(xì)胞中的表達(dá)與其阿霉素耐藥細(xì)胞株的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)明顯差異。ST6GALNAC4在三種耐藥細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)(*P0.05)；而ST6GALNAC3和ST6GALNAC5在三對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株中無(wú)表達(dá)。(2) ST6GALNAC4在CML/MDR患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中呈高表達(dá)(*P0.05)。ST6GALNAC1、ST6GALNAC2和ST6GALNAC6的表達(dá)在兩組中無(wú)明顯差異。ST6GALNAC3和ST6GALNAC5在兩組中表達(dá)量較少。(3)干擾ST6GALNAC4后的KCL22/ADR細(xì)胞株在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)均顯著降低,作用于KCL22/ADR-ST6GALNAC4 shRNA1細(xì)胞的抗腫瘤藥物的IC50值明顯低于對(duì)照組。在經(jīng)阿霉素治療的小鼠和未經(jīng)阿霉素治療的小鼠中,注射KCL22/ADR-ST6GALNAC4 shRNA1的小鼠平均瘤體積均顯著低于shRNA對(duì)照組(*P0.05)。(4)過(guò)表達(dá)ST6GALNAC4,作用于KCL22/ST6GALNAC4細(xì)胞的抗腫瘤藥物的IC50值明顯高于KCL22/mock細(xì)胞的IC50值。在經(jīng)過(guò)阿霉素治療的小鼠和未經(jīng)阿霉素治療的小鼠中,注射KCL22/ST6GALNAC4后的平均瘤體積均明顯高于KCL22/mock組。(5)在KCL22、K562和KU812細(xì)胞以及慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-4299的表達(dá)量明顯上升,而ST6GALNAC4在化學(xué)敏感細(xì)胞株及藥物敏感患者的細(xì)胞中表達(dá)是下降的。在KCL22/ADR細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR-4299模擬物后,ST6GALNAC4的mRNA及蛋白的表達(dá)量明顯的下降；在轉(zhuǎn)染了miR-4299拮抗劑的KCL22細(xì)胞中,則表現(xiàn)出相反的結(jié)果。而且,轉(zhuǎn)染了wt 3'-UTR載體的KCL22/ADR細(xì)胞中miR-4299表達(dá)的熒光素酶活性明顯下降,但是mtST6GALNAC4可以逆轉(zhuǎn)此結(jié)果。(6)MiR-4299的高表達(dá)可上調(diào)KCL22/ADR細(xì)胞對(duì)化學(xué)藥物的敏感性,阿霉素、紫杉醇和長(zhǎng)春新堿的IC50值下降；同時(shí),在KCL22細(xì)胞中miR-4299被拮抗劑所抑制后,可觀察到這三種化療藥物的IC50值上升。轉(zhuǎn)染了miR-4299的小鼠的腫瘤體積在經(jīng)過(guò)阿霉素化療后有明顯的改變,并且改變miR-44299的表達(dá)可以調(diào)節(jié)ST6GALNAC4 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)論：(1) ST3GAL家族和ST6GALNAC家族在三對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病親本細(xì)胞株及其三對(duì)化學(xué)耐藥細(xì)胞株中存在差異表達(dá)。(2) ST3GAL家族和ST6GALNAC家族在耐藥與非耐藥的慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中存在差異表達(dá)。(3)改變ST3GAL1和ST6GALNAC4的表達(dá),可以調(diào)控KCL22和KCL22/ADR細(xì)胞體內(nèi)、外的藥物敏感性。ST3GAL1和ST6GALNAC4可以作為臨床慢性粒細(xì)胞白血病多藥耐藥的診斷和預(yù)后的標(biāo)記物,可作為治療白血病耐藥性潛在的靶點(diǎn)。(4) MiR-4701-5p以ST3GAL1為靶點(diǎn)和miR-4299以ST6GALNAC4為靶點(diǎn),可作為慢性粒細(xì)胞白血病多藥耐藥性所特有的miRNA來(lái)調(diào)節(jié)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的多藥耐藥性。
【圖文】：

通過(guò)測(cè)量所形成的腫瘤體積來(lái)驗(yàn)證阿霉素的治療效果。圖２Ｄ所示，在逡逑阿霉素治療組中的小鼠所形成的腫瘤體積隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增長(zhǎng)，，但其腫瘤體積逡逑X棾さ乃俾室饗緣陀諼淳⒚顧刂瘟頻男∈�。蕦�(dǎo)噬希淳⒚顧刂瘟頻男″義鮮笤詰冢玻碧斕降冢玻柑炱詡�，可嬠矓屉A⑸洌耍茫蹋玻玻粒模遙澹櫻裕叮牽粒蹋危粒茫村澹螅瑁遙危粒戾義系男∈篤驕鎏寤賈陀冢螅瑁遙危煉哉兆椋ǎ校跡埃埃擔(dān)�。哉a⒚顧刂瘟頻男∈籩兇㈠義仙洌耍茫蹋玻玻粒模遙澹櫻裕叮牽粒蹋危粒茫村澹螅瑁遙危粒斕男∈篤驕鎏寤嗍竅災(zāi)陀冢螅杳瘢危鈴義隙哉兆椋ㄟ擔(dān)跡埃埃擔(dān)�。辶x

本文編號(hào)：2570389