【摘要】：[研究背景和目的]胃癌是世界上死亡率較高的疾病,且發(fā)現(xiàn)的時候大多數(shù)是進展期,早期胃癌的5年生存率在70-75%左右[2],但進展期的5年生存率只有35%。提高生存率是我們的主要治療目標。化療是當前治療胃癌的主要手段之一[3],盡管新的抗癌藥物及化療方案不斷推出,但治療效果仍無明顯進展,其主要原因就是胃癌細胞對化療藥物產(chǎn)生了多藥耐藥,從而使化療藥物的應用受到明顯的限制。低氧環(huán)境是多種實體腫瘤包括胃癌的特征之一,低氧下發(fā)生化療抵抗是腫瘤化療失敗的重要原因,多種化療藥物低氧下抗腫瘤作用減弱[4]。由于腫瘤的低氧微環(huán)境、腫瘤干細胞的存在等多種原因發(fā)生放化療抵抗、多藥耐藥,最終導致治療失敗。5-Fu是一種抗代謝的化療藥物,是國內(nèi)外腫瘤臨床輔助化療和新輔助化療最常選用的藥物之一,它能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶,從而阻斷脫氧尿苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣剀账?影響細胞DNA的合成導致細胞損傷和死亡。臨床試驗表明包含5-Fu的化療方案能提高胃癌患者的生存率,但仍存在局部治療的失敗和遠處轉(zhuǎn)移。有研究結(jié)果表明,患者癌細胞內(nèi)低氧環(huán)境導致了耐藥性存在,降低了的5-Fu的療效。近年的研究認為,腫瘤組織中存在的腫瘤干細胞,是腫瘤產(chǎn)生、轉(zhuǎn)移、復發(fā)、耐藥及放化療抵抗的主要原因。研究腫瘤干細胞可以幫助我們更好的了解腫瘤的生物學特性和改善腫瘤的化療抵抗。但至目前,尚無法直接分離鑒定其中的干細胞,我們只能選擇跟腫瘤干細胞關(guān)系密切的某些標志物來研究。塞來昔布是非甾體類抗炎藥的一種,是選擇性的環(huán)氧化酶2抑制劑,有抗炎、鎮(zhèn)痛作用,根據(jù)國內(nèi)外臨床及實驗研究表明,塞來昔布還具有抑制腫瘤的作用,但非甾體類抗炎藥抗腫瘤的確切機制尚不清楚[12-14]。鑒于以上的研究結(jié)果,我們擬通過觀察5-Fu、塞來昔布以及它們的聯(lián)合用藥對體外生長的人胃癌細胞及對裸鼠人胃癌移植瘤的抑制作用,以及與腫瘤干細胞標記物HIF-2α、ABCG2、OCT-4表達的關(guān)系,探討5-Fu與塞來昔布聯(lián)合應用是否能通過降低人胃癌細胞及裸鼠人胃癌移植瘤的干細胞標記物HIF-2α、ABCG2、 OCT-4的表達,從而改善和逆轉(zhuǎn)5-Fu的化療抵抗。[方法]1.體外實驗：將人胃癌細胞株SGC7901接種于RPMI1640培養(yǎng)液中,常規(guī)傳代培養(yǎng)。化學缺氧劑CoCl2(濃度為150μmol/L)用于模擬腫瘤內(nèi)低氧微環(huán)境。取對數(shù)生長期的SGC7901細胞以2×105/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板,每孔體積為200μ1。實驗分4組：低氧對照組、5-Fu組、塞來昔布組、聯(lián)合組。MTT法測定低氧下不同濃度的5-Fu、塞來昔布及聯(lián)合組分別對胃癌細胞的增殖抑制率,免疫細胞化學法、RT-PCR、Western-blot法觀察各組SGC7901細胞HIF-2α、 ABCG2、OCT-4的蛋白和mRNA的表達。2.體內(nèi)實驗：選用5-6周齡雄性裸鼠共28只,體重18-22g,取對數(shù)生長期的SGC7901人胃癌細胞懸液,無菌條件下將細胞懸液接種于裸鼠右腋皮下,繼續(xù)飼養(yǎng)2周,建立裸鼠荷瘤模型。并將裸鼠分為4組：空白對照組、5-Fu組、塞來昔布組、聯(lián)合組。末次給藥后次日,處死動物,剖取瘤體組織,電子天平稱重瘤塊,計算各組抑瘤率,測量腫瘤的長短徑,計算腫瘤體積。免疫組織化學法、RT-PCR、 Western-blot法觀察各組HIF-2α、ABCG2、OCT-4蛋白和]mRNA的表達。[結(jié)果]1.5-Fu聯(lián)合塞來昔布對體外SGC7901細胞的抑制作用：低氧環(huán)境下,不同濃度的5-Fu和塞來昔布呈劑量依賴性的抑制SGC7901細胞增殖,接種后的細胞在48小時處于對數(shù)生長期,經(jīng)公式計算出5-Fu和塞來昔布對SGC7901細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別約為200mg/L、100 μmol/L。低氧下半數(shù)抑制濃度的5-Fu、塞來昔布和聯(lián)合組作用于SGC7901細胞48小時后,其生長抑制率分別為52.61%、46.1%、66.09%,低氧下5-Fu、塞來昔布和聯(lián)合組都能抑制SGC7901細胞的增殖,但以聯(lián)合組抑制率最高,聯(lián)合組與其它組比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=35.237,P0.05)。低氧對照組HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白呈較高水平表達,5-Fu組加入半數(shù)抑制濃度的5-Fu作用48小時,HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白的表達進一步增加,但在塞來昔布組和聯(lián)合組均呈較低水平表達,5-Fu組、塞來昔布組、聯(lián)合組與低氧對照組兩兩比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(mRNA: HIF-2αF=819.242, ABCG2 F=515.693, OCT-4 F= 1929.264, P0.01。蛋白：HIF-2αF=4788.138, ABCG2 F=1739.794, OCT-4 F= 25656.397, P0.01)。2.5-Fu聯(lián)合塞來昔布對裸鼠人胃癌移植瘤的抑制作用：5-Fu、塞來昔布和聯(lián)合組均能抑制裸鼠胃癌移植瘤的生長,但5-Fu組的平均瘤重及體積與對照組比較,差別無統(tǒng)計學意義(P0.05),塞來昔布組和聯(lián)合用藥組瘤塊的平均瘤重及體積顯著小空白對照組(P0.05),且聯(lián)合用藥組顯著小于5-Fu組和塞來昔布組(P0.05),抑瘤率分別為26.36%、59.70%、88.37%,以聯(lián)合組抑瘤率最高,聯(lián)合組與5-Fu組、塞來昔布與5-Fu組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)�？瞻讓φ战MHIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白呈較高水平表達,5-Fu組HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白的表達進一步增加,但在塞來昔布組和聯(lián)合組均呈較低水平表達,5-Fu組、塞來昔布組、聯(lián)合組與對照組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。[結(jié)論]1.塞來昔布對低氧環(huán)境下體外生長的人胃癌SGC7901細胞和體內(nèi)生長的裸鼠人胃癌移植瘤均具有抑制作用,其機制可能與通過減少腫瘤細胞和腫瘤組織中干細胞標記物HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白的表達有關(guān)。2.5-Fu與塞來昔布在體內(nèi)、體外聯(lián)合應用均有協(xié)同抗腫瘤作用,其機制可能是通過減少胃癌SGC7901細胞和裸鼠人胃癌移植瘤腫瘤組織中HIF-2α、ABCG2、 OCT-4 mRNA及蛋白等腫瘤干細胞標記物的表達,改善或逆轉(zhuǎn)胃癌的化療抵抗,從而增強化療效果。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2

【共引文獻】

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本文編號：2565713