【摘要】：蛋白質(zhì)糖基化是一種常見的翻譯后修飾,其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān),涉及腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞解離與侵襲、細(xì)胞與基質(zhì)間相互作用、血管生成、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移等過程。糖蛋白與疾病的關(guān)系,尤其與癌癥相關(guān)的研究已取得進(jìn)展。結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin,Hp)是一種酸性糖蛋白,主要由肝臟合成和降解,已發(fā)現(xiàn)在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中其聚糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。本研究運(yùn)用親和層析原理純化血清Hp,通過抗體輔助的凝集素芯片及凝集素印跡,比較分析正常和肝癌血清中糖蛋白Hp的凝集素親和譜,解析肝癌血清Hp特征性聚糖結(jié)構(gòu);建立基于凝集素偶聯(lián)磁珠的快速檢測(cè)方法,評(píng)估差異性Hp聚糖作為糖生物標(biāo)志物及其在肝癌診斷中的潛在應(yīng)用價(jià)值。第一部分肝癌患者血清Hp特征性聚糖譜圖構(gòu)建及驗(yàn)證本部分應(yīng)用抗體輔助的凝集素芯片技術(shù)比較研究了肝癌患者和正常受試者血清中Hp凝集素親和譜,同時(shí)采用凝集素印跡的方法驗(yàn)證,獲得肝癌血清Hp的特征性糖譜。結(jié)果表明,肝癌患者血清Hp對(duì)凝集素LCA、UEA I、AAL、SNA-I、Con A、CALSEPA、RCA I、PHA-L和Jacalin的親和作用增強(qiáng),而對(duì)凝集素LEL和PHA-E親和作用減弱。通過凝集素親和譜的聚糖結(jié)構(gòu)推斷,提示肝癌患者血清糖蛋白Hp末端和核心巖藻糖、α2,6-唾液酸、高甘露糖、α-甘露糖、β1,4-半乳糖、β1,6分支糖鏈結(jié)構(gòu)、T/Tn抗原和唾液酸化T抗原增加;而N-乙酰葡萄糖胺β1,4分支和平分型結(jié)構(gòu)減少。選取PHA-E、AAL、LCA、SNA-I、Jacalin和PHA-L進(jìn)行凝集素印跡驗(yàn)證,結(jié)果與抗體輔助凝集素芯片結(jié)果一致,提示Hp異常的糖基化修飾與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。第二部分基于凝集素磁珠的快速ELISA檢測(cè)系統(tǒng)建立及血清Fuc-Hp臨床應(yīng)用評(píng)估肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一種常見惡性腫瘤,占肝癌總發(fā)病率的80%以上。肝臟病變,尤其是肝癌的發(fā)生發(fā)展伴隨著糖基化異常改變。前期研究發(fā)現(xiàn),Hp的巖藻糖基化聚糖(Fuc-Hp)含量在肝癌患者血清中顯著升高。本研究通過建立高通量高靈敏度的靶蛋白糖基化定量分析方法,旨在研究巖藻糖基化Hp對(duì)原發(fā)性肝癌的臨床診斷價(jià)值。本研究通過對(duì)兩種傳統(tǒng)凝集素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Lectin ELISA)進(jìn)行比較,在優(yōu)勢(shì)方法—反相凝集素ELISA的基礎(chǔ)上聯(lián)合磁珠,建立了基于凝集素磁珠的快速ELISA檢測(cè)方法。同時(shí)檢測(cè)260例正常和肝癌患者血清中Fuc-Hp含量和Hp蛋白水平,建立Fuc-Hp指數(shù)(Fuc-Hp/Hp=Fuc-Hp含量/Hp蛋白水平;ELISA Index=Fuc-Hp光密度值/Hp蛋白光密度值)用于反映單位Hp的巖藻糖基化程度。結(jié)果顯示,血清Fuc-Hp含量、Fuc-Hp/Hp與ELISA Index:(1)在肝癌組和AFP陰性肝癌組比正常組均顯著增高;(2)與AFP聯(lián)合檢測(cè)診斷肝癌,靈敏度、特異性以及準(zhǔn)確性均大幅度提高。本部分研究表明,Fuc-Hp及其指數(shù)對(duì)肝癌,尤其是AFP陰性肝癌有良好的預(yù)測(cè)和診斷效能;Fuc-Hp指數(shù)與AFP聯(lián)合檢測(cè)可提高肝癌預(yù)測(cè)和診斷效率。結(jié)論1.運(yùn)用抗體輔助的凝集素芯片與凝集素印跡技術(shù),篩選出9種親和信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)和2種親和信號(hào)強(qiáng)度減弱的凝集素,通過聚糖結(jié)構(gòu)分析,構(gòu)建肝癌特征性血清Hp聚糖譜圖。2.建立了基于凝集素磁珠的快速ELISA檢測(cè)方法,并用于分析血清Hp巖藻糖基化改變,初步獲得了AFP陰性和AFP陽性肝癌通用的候選生物標(biāo)記物。3.Fuc-Hp在肝癌患者血清中顯著升高,證明其作為聚糖標(biāo)志物診斷肝癌的潛在應(yīng)用價(jià)值。Fuc-Hp/Hp或ELISA Index與AFP聯(lián)合診斷可提高肝癌預(yù)測(cè)和診斷能力。創(chuàng)新性1.肝癌患者血清中Hp的特征性聚糖結(jié)構(gòu),可作為潛在聚糖分子標(biāo)志物,為肝癌早診早治提供新的診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。2.基于凝集素以及凝集素偶聯(lián)磁珠的Hp異質(zhì)體檢測(cè)系統(tǒng)的建立,為靶蛋白糖基化定量分析提供了新方法和新思路。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

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