【摘要】：目的:通過(guò)分析T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor,TCR)分子在CIK誘導(dǎo)過(guò)程中的表達(dá)變化情況,以及TCR基因的修飾或缺失是否影響CIK的殺傷活性,分析CIK中TCR分子是否發(fā)揮了功能,為以后基于CIK的特異性TCR基因修飾用于靶向治療腫瘤的研究奠定基礎(chǔ)。方法:一、CIK細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中TCR表達(dá)譜的變化研究采集健康志愿者外周血,Ficoll法分離單個(gè)核細(xì)胞,按照CIK誘導(dǎo)方法完成對(duì)CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng),并在0天、7天和14天分別取樣,經(jīng)過(guò)流式分選不同表型細(xì)胞,分別提取總RNA,經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄,多重PCR擴(kuò)增,然后利用Ge XP多重基因分析系統(tǒng)分析各組樣品中22個(gè)TCRVβ亞家族的CDR3長(zhǎng)度和譜型,并利用內(nèi)參GAPDH平衡各組之間的差異,計(jì)算出各TCRVβ亞家族的表達(dá)量,分析不同時(shí)間以及不同組之間的差異變化。二、CIK細(xì)胞轉(zhuǎn)染特異性TCR后殺傷功能的檢測(cè)擴(kuò)增survivin抗原肽優(yōu)勢(shì)取用基因TCR Vα4、Vβ7的重組腺病毒Ad5/F35-p DC315-TCRVα4-IRES-Vβ7,病毒滴度測(cè)定,按MOI比為1:20感染培養(yǎng)7天的CIK細(xì)胞,感染48小時(shí),以30:1的效靶比殺傷四種不同腫瘤細(xì)胞系,對(duì)比感染前后殺傷功能的變化。三、7402-TCR-YFP穩(wěn)轉(zhuǎn)系的建立構(gòu)建c DNA3.1-TCR-YFP質(zhì)粒,經(jīng)過(guò)線(xiàn)性化酶切,轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)增殖期的7402細(xì)胞系,經(jīng)過(guò)G418篩選,初步建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,然后經(jīng)單克隆篩選,建立7402-TCR-YFP單克隆細(xì)胞系。四、CRISPR-Cas9-TCRBC敲除質(zhì)粒的構(gòu)建及其功能驗(yàn)證利用CRISPR網(wǎng)站提供的靶向編輯位點(diǎn)篩選工具,設(shè)計(jì)出3個(gè)敲除位點(diǎn),并針對(duì)這三個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建CRISPR-Cas9-TCR敲除質(zhì)粒,其中包括不帶熒光的PX330和帶有GFP的PX458質(zhì)粒,并用構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)轉(zhuǎn)的7402細(xì)胞系、常規(guī)Hep G2細(xì)胞系,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合PCR、T-A克隆測(cè)序等方法驗(yàn)證CRISPR-Cas9-TCR敲除質(zhì)粒的功能。結(jié)果:一、CIK誘導(dǎo)培養(yǎng)之后TCR表達(dá)譜并未發(fā)生太大變化。利用Ge XP多重基因分析系統(tǒng)完成對(duì)0天CD3+T、CD3+CD8+T、CD3+CD4+T,7天CD3+T、CD3+CD56+T、CD3+CD56-T以及14天CD3+T、CD3+CD56+T、CD3+CD56-T細(xì)胞群的TCRVβCDR3表達(dá)譜的研究工作。從整體水平上看,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),TCR表達(dá)譜并未出現(xiàn)較大偏移,每個(gè)家族都呈現(xiàn)出典型的多克隆鐘形分布,只有0天在T細(xì)胞中檢測(cè)到寡克隆表達(dá)的Vβ8和Vβ16家族,選擇性的在CD3+CD56+T細(xì)胞群中出現(xiàn)較高表達(dá),而沒(méi)有在CD3+CD56-T細(xì)胞群中出現(xiàn)單克隆性高表達(dá),并且在Vβ16在CD3+CD56+細(xì)胞群中的比例高于初始CD3+CD8+T細(xì)胞中的比例。二、轉(zhuǎn)Survivin特異性TCR的CIK細(xì)胞對(duì)HLA-A2+Survivin+腫瘤細(xì)胞有顯著增強(qiáng)成功擴(kuò)增Survivin特意性的Ad5/F35-p DC315-TCRVα4-IRES-Vβ7重組腺病毒,以MOI比為1:20感染培養(yǎng)7天的CIK細(xì)胞,48小時(shí)后,用TCRBV7抗體檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CIK細(xì)胞陽(yáng)性率為9.7%(對(duì)照組為4.5%),鈣黃綠素釋放法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的CIK細(xì)胞對(duì)7402、Hep G2、MCF-7、H1299四種靶細(xì)胞殺傷效率,發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞轉(zhuǎn)染Survivn特異性TCR基因后,對(duì)Hep G2(HLA-A2+、Survivin+)和MCF-7(HLA-A2+、Survivin+)殺傷效果大大增強(qiáng),然而對(duì)于肝癌細(xì)胞株7402(HLA-A2-、Survivin+)和H1299(HLA-A2-、Survivin-)的殺傷能力卻并沒(méi)有明顯增強(qiáng)效果。三、成功構(gòu)建7402-TCR-YFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系成功構(gòu)建7402-TCR-YFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,并通過(guò)單克隆培養(yǎng),建立單克隆細(xì)胞系流式檢測(cè)YFP熒光效率為70%。四、成功構(gòu)建CRISPR-Cas9-TCRBC質(zhì)粒,并完成功能驗(yàn)證針對(duì)設(shè)計(jì)的3個(gè)靶位點(diǎn)成功構(gòu)建出,PX330和PX458兩種敲除質(zhì)粒,用三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)轉(zhuǎn)7402細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)S位點(diǎn)敲除效率最高,轉(zhuǎn)染5天流式檢測(cè)7402穩(wěn)轉(zhuǎn)系熒光率從75%下降到35%。然后利用PX458-S質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞系,流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率為22.4%,然后提取基因組DNA,通過(guò)PCR,T-A克隆測(cè)序,在20個(gè)單克隆中有4個(gè)發(fā)生插入,且插入堿基均為單一A堿基,插入位點(diǎn)均為PAM位點(diǎn)上游第4個(gè)堿基處,整體突變率為20%,相對(duì)于轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞比例22.4%,有效編輯率約為89.2%。結(jié)論:成功建立CIK細(xì)胞不同天數(shù)、不同亞群的TCRVβ表達(dá)譜,通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)過(guò)程中,絕大多數(shù)表達(dá)譜沒(méi)有發(fā)生偏移,但是對(duì)于有些特異性的T細(xì)胞,卻出現(xiàn)了分布的差異性。成功擴(kuò)增Survivin特異性重組腺病毒,轉(zhuǎn)染CIK,殺傷實(shí)驗(yàn)初步證明了CIK細(xì)胞中TCR的作用。成功構(gòu)建7402-TCR-YFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,成功構(gòu)建出CRISPR-Cas9-TCR敲除質(zhì)粒,并證明CRISPR-Cas9-S具有最高的位點(diǎn)識(shí)別和敲除效率。
【圖文】：

廣東藥學(xué)院碩士研究生畢業(yè)論文1.3.3 多重 PCR 擴(kuò)增 TCRVβ 片段 CDR3 區(qū)電泳結(jié)果各樣品經(jīng)多重 PCR 反應(yīng)后，條帶相互之間間隔清晰，并且條帶位置與目的大小相符，，表明特異性較好，可進(jìn)行下一步 GEXP 上機(jī)檢測(cè)。如圖 1-1 所示，為 7 天、14 天和 0 天部分細(xì)胞群電泳圖。AA

天、14天CD3+C56+細(xì)胞群對(duì)比0天CD3+CD8+細(xì)胞群TCR表達(dá)譜峰型結(jié)
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R73-3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Antitumor activities of human autologous cytokineinduced killer(CIK)cells against hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo[J];World Journal of Gastroenterology;2002年03期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 王騰;GeXP多基因遺傳表達(dá)系統(tǒng)檢測(cè)人TCRVα和TCRVβ鏈CDR3譜型及長(zhǎng)度的方法建立以及初步應(yīng)用[D];廣東藥學(xué)院;2013年

本文編號(hào)：2559627