【摘要】：目的:通過分析T細胞抗原受體(T cell receptor,TCR)分子在CIK誘導過程中的表達變化情況,以及TCR基因的修飾或缺失是否影響CIK的殺傷活性,分析CIK中TCR分子是否發(fā)揮了功能,為以后基于CIK的特異性TCR基因修飾用于靶向治療腫瘤的研究奠定基礎。方法:一、CIK細胞培養(yǎng)過程中TCR表達譜的變化研究采集健康志愿者外周血,Ficoll法分離單個核細胞,按照CIK誘導方法完成對CIK細胞的誘導培養(yǎng),并在0天、7天和14天分別取樣,經過流式分選不同表型細胞,分別提取總RNA,經過逆轉錄,多重PCR擴增,然后利用Ge XP多重基因分析系統(tǒng)分析各組樣品中22個TCRVβ亞家族的CDR3長度和譜型,并利用內參GAPDH平衡各組之間的差異,計算出各TCRVβ亞家族的表達量,分析不同時間以及不同組之間的差異變化。二、CIK細胞轉染特異性TCR后殺傷功能的檢測擴增survivin抗原肽優(yōu)勢取用基因TCR Vα4、Vβ7的重組腺病毒Ad5/F35-p DC315-TCRVα4-IRES-Vβ7,病毒滴度測定,按MOI比為1:20感染培養(yǎng)7天的CIK細胞,感染48小時,以30:1的效靶比殺傷四種不同腫瘤細胞系,對比感染前后殺傷功能的變化。三、7402-TCR-YFP穩(wěn)轉系的建立構建c DNA3.1-TCR-YFP質粒,經過線性化酶切,轉染處于對數增殖期的7402細胞系,經過G418篩選,初步建立穩(wěn)定表達細胞系,然后經單克隆篩選,建立7402-TCR-YFP單克隆細胞系。四、CRISPR-Cas9-TCRBC敲除質粒的構建及其功能驗證利用CRISPR網站提供的靶向編輯位點篩選工具,設計出3個敲除位點,并針對這三個位點構建CRISPR-Cas9-TCR敲除質粒,其中包括不帶熒光的PX330和帶有GFP的PX458質粒,并用構建好的質粒轉染穩(wěn)轉的7402細胞系、常規(guī)Hep G2細胞系,通過流式細胞術結合PCR、T-A克隆測序等方法驗證CRISPR-Cas9-TCR敲除質粒的功能。結果:一、CIK誘導培養(yǎng)之后TCR表達譜并未發(fā)生太大變化。利用Ge XP多重基因分析系統(tǒng)完成對0天CD3+T、CD3+CD8+T、CD3+CD4+T,7天CD3+T、CD3+CD56+T、CD3+CD56-T以及14天CD3+T、CD3+CD56+T、CD3+CD56-T細胞群的TCRVβCDR3表達譜的研究工作。從整體水平上看,隨著培養(yǎng)時間的延長,TCR表達譜并未出現(xiàn)較大偏移,每個家族都呈現(xiàn)出典型的多克隆鐘形分布,只有0天在T細胞中檢測到寡克隆表達的Vβ8和Vβ16家族,選擇性的在CD3+CD56+T細胞群中出現(xiàn)較高表達,而沒有在CD3+CD56-T細胞群中出現(xiàn)單克隆性高表達,并且在Vβ16在CD3+CD56+細胞群中的比例高于初始CD3+CD8+T細胞中的比例。二、轉Survivin特異性TCR的CIK細胞對HLA-A2+Survivin+腫瘤細胞有顯著增強成功擴增Survivin特意性的Ad5/F35-p DC315-TCRVα4-IRES-Vβ7重組腺病毒,以MOI比為1:20感染培養(yǎng)7天的CIK細胞,48小時后,用TCRBV7抗體檢測轉染后CIK細胞陽性率為9.7%(對照組為4.5%),鈣黃綠素釋放法檢測轉染后的CIK細胞對7402、Hep G2、MCF-7、H1299四種靶細胞殺傷效率,發(fā)現(xiàn)CIK細胞轉染Survivn特異性TCR基因后,對Hep G2(HLA-A2+、Survivin+)和MCF-7(HLA-A2+、Survivin+)殺傷效果大大增強,然而對于肝癌細胞株7402(HLA-A2-、Survivin+)和H1299(HLA-A2-、Survivin-)的殺傷能力卻并沒有明顯增強效果。三、成功構建7402-TCR-YFP穩(wěn)轉細胞系成功構建7402-TCR-YFP穩(wěn)轉細胞系,并通過單克隆培養(yǎng),建立單克隆細胞系流式檢測YFP熒光效率為70%。四、成功構建CRISPR-Cas9-TCRBC質粒,并完成功能驗證針對設計的3個靶位點成功構建出,PX330和PX458兩種敲除質粒,用三種質粒轉染穩(wěn)轉7402細胞系,發(fā)現(xiàn)S位點敲除效率最高,轉染5天流式檢測7402穩(wěn)轉系熒光率從75%下降到35%。然后利用PX458-S質粒轉染Hep G2細胞系,流式檢測轉染效率為22.4%,然后提取基因組DNA,通過PCR,T-A克隆測序,在20個單克隆中有4個發(fā)生插入,且插入堿基均為單一A堿基,插入位點均為PAM位點上游第4個堿基處,整體突變率為20%,相對于轉染成功的細胞比例22.4%,有效編輯率約為89.2%。結論:成功建立CIK細胞不同天數、不同亞群的TCRVβ表達譜,通過對比發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)過程中,絕大多數表達譜沒有發(fā)生偏移,但是對于有些特異性的T細胞,卻出現(xiàn)了分布的差異性。成功擴增Survivin特異性重組腺病毒,轉染CIK,殺傷實驗初步證明了CIK細胞中TCR的作用。成功構建7402-TCR-YFP穩(wěn)轉細胞系,成功構建出CRISPR-Cas9-TCR敲除質粒,并證明CRISPR-Cas9-S具有最高的位點識別和敲除效率。
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廣東藥學院碩士研究生畢業(yè)論文1.3.3 多重 PCR 擴增 TCRVβ 片段 CDR3 區(qū)電泳結果各樣品經多重 PCR 反應后，條帶相互之間間隔清晰，并且條帶位置與目的大小相符，，表明特異性較好，可進行下一步 GEXP 上機檢測。如圖 1-1 所示，為 7 天、14 天和 0 天部分細胞群電泳圖。AA

天、14天CD3+C56+細胞群對比0天CD3+CD8+細胞群TCR表達譜峰型結
【學位授予單位】：廣東藥學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R73-3

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 ;Antitumor activities of human autologous cytokineinduced killer(CIK)cells against hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo[J];World Journal of Gastroenterology;2002年03期

相關碩士學位論文 前1條

1 王騰;GeXP多基因遺傳表達系統(tǒng)檢測人TCRVα和TCRVβ鏈CDR3譜型及長度的方法建立以及初步應用[D];廣東藥學院;2013年

本文編號：2559627