【摘要】：1、背景：根據世界衛(wèi)生組織相關報道,腫瘤已經超越心血管疾病成為世界上首要致死疾病。已有大量研究致力于闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展機制,為腫瘤診斷及治療提供依據。近年來,腫瘤微環(huán)境這個重要概念的提出促進了靶向腫瘤基質的新型治療方法的出現(xiàn)。尤其是成纖維細胞、巨噬細胞、內皮細胞等能夠促進腫瘤生長的間質成分,越來越成為腫瘤治療的重要目標。腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細胞及細胞外間質相互作用所形成的特殊環(huán)境,細胞外間質成分包括成纖維細胞、炎癥細胞,血管內皮細胞,血管周細胞,間充質干細胞,細胞外基質及多種細胞因子,其中,腫瘤相關成纖維細胞是微環(huán)境中的主要間質成分。腫瘤相關成纖維細胞最常見的標志物是a-SMA,但是僅僅通過a-SMA檢測不足以鑒定CAFs[10,19,20],其他廣泛應用的CAFs標志物還包括成纖維細胞特異性蛋白(FSP),成纖維細胞激活蛋白(FAP),血小板衍化生長因子受體a/β(PDGFRa/β)[14,。FSP調控細胞周期、參與維持完整的細胞骨架,其異常表達能夠促進腫瘤的生長、增殖、轉移。FAP特異性表達于血管周細胞以及創(chuàng)傷修復過程中及腫瘤間質中的活化成纖維細胞。FAP在90%的實體腫瘤中可被激活。在人類90%腫瘤中可以檢測到PDGFRa/β[13]。不同類型腫瘤中的CAFs具有高度異質性,其來源尚有爭議,可能來源于宿主間質成纖維細胞、內皮細胞、上皮細胞以及骨髓間質干細胞等。許多體內外實驗的均已證實CAFs能分泌生長因子促進腫瘤的生長及轉移。由于CAFs是腫瘤間質中的主要細胞類型又具有促瘤作用,靶向CAFs的藥物治療手段越來越受到人們的重視。因此,我們此項研究致力于在體外環(huán)境下模擬正常成纖維細胞的活化過程,并探討在此過程中腫瘤細胞及成纖維細胞的性狀各發(fā)生何種變化。2、研究方法2.1光鏡下觀察小鼠胚胎來源的成纖維細胞在共培養(yǎng)前和共培養(yǎng)30d后形態(tài)變化,并通過細胞免疫熒光鑒定該成纖維細胞的來源。2.2將小鼠胚胎成纖維細胞系NIH/3T3與小鼠結腸癌細胞系CT26進行體外間接共培養(yǎng),將共培養(yǎng)3d、6d、9d、12d、15d的成纖維細胞與未經處理的NFs細胞,行a-SMA蛋白熒光染色,以lOng/ml重組人TGF-β作用72h的成纖維細胞作為活化成纖維細胞的標準,比較共培養(yǎng)不同時間的成纖維細胞的活化程度的變化。2.3采用a-SMA、FAP、FSP1、PDGFRa/(3作為活化成纖維細胞特異性標志物,比較共培養(yǎng)后正常成纖維細胞上述蛋白表達水平變化。取共培養(yǎng)Od、3d、6d、9d、 12d.15d、30d的成纖維細胞做Western blot檢測,以單獨培養(yǎng)的經過相同傳代次數(shù)的NFs作為陰性對照組,以lOng/ml重組人TGF-β作用NFs 72h作為陽性對照。2.4收集共培養(yǎng)Od.6d、15d.30d的大腸癌細胞CT26消化離心,2%血清培養(yǎng)基重懸細胞作為實驗組,對照組用2%血清培養(yǎng)液重懸未經過共培養(yǎng)但經過相同傳代次數(shù)的普通CT26細胞,配制細胞懸液濃度為5×105/ml,向transwell小室的上室中加入200μ1單細胞懸液,向transwell小室的下室中加10%血清濃度的培養(yǎng)液600u1。放入細胞培養(yǎng)箱12h后,取出小室,進行HE染色,顯微鏡下觀察穿過的腫瘤細胞。2.5將共培養(yǎng)15d、30d及普通培養(yǎng)但經過相同傳代次數(shù)的CT26細胞分別進行劃痕實驗,分別在Oh、6h、12h、24h鏡下觀察,并拍照,將照片上傳wimasis.com網站進行數(shù)據分析每個時間點腫瘤細胞覆蓋面積。2.6取普通培養(yǎng)的CT26細胞按30萬/孔種六孔板作為對照組,隔天加藥,分別是順鉑(0.10.20.40.80.160umol/1)；奧沙利鉑(0.20.40.80.160.320umol/1);氟尿吡啶(0.10.20.40.80.160umol/l)；伊立替康(0、20.40.80.160. 320umol/l)。藥物作用24h后,胰酶消化,離心、重懸、臺盼藍染色、計數(shù)、計算不同藥物不同濃度作用下CT26細胞的存活率,每種藥物至少重復三次。選取經過共培養(yǎng)30d的CT26細胞重復上述實驗。2.7收集與大腸癌細胞CT26間接共培養(yǎng)30d的成纖維細胞作為實驗組,培養(yǎng)相同時間并經歷相同傳代次數(shù)的正常成纖維細胞作為對照組,分別從細胞中提取總RNA,利用microRNA芯片技術對其進行分析,篩選出表達差異譜。3、結果：3.1經共培養(yǎng)后,成纖維細胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變。通過細胞免疫熒光鑒定本研究培養(yǎng)的成纖維細胞,結果提示Vimentin(+).α-SMA部分(+)、Pan cytokeratin(-). Desmin(-),提示該細胞為間質成分來源且成分較為均一。3.2隨著共培養(yǎng)時間的延長α-SMA陽性細胞比例顯著升高,且表達增強,同時細胞骨架變大變寬,表明正常成纖維細胞向肌源性成纖維細胞即活化成纖維細胞轉化,當共培養(yǎng)時間達到15d左右,成纖維細胞達到活化狀態(tài)。3.3隨著共培養(yǎng)時間的延長,成纖維細胞中α-SMA、FAP.FSP.PDGFRβ的表達水平逐漸升高,共培養(yǎng)2w左右,成纖維細胞上述蛋白的表達水平已達到與陽性對照組相當水平,結合之前免疫細胞化學結果,我們可以判斷,共培養(yǎng)15d左右,成纖維細胞達到活化狀態(tài)。3.4未經過共培養(yǎng)的CT26細胞12h后幾乎沒有細胞穿過8.0um聚碳酸酯膜,共培養(yǎng)6d、15d、30d的腫瘤細胞穿過聚碳酸酯膜的數(shù)目逐漸增多,結果表明,隨著共培養(yǎng)時間的增加,腫瘤細胞轉移能力增強。3.5在Oh,三組腫瘤細胞(共培養(yǎng)30d、共培養(yǎng)15d、共培養(yǎng)Od)覆蓋面積分別為62.9%、62.6%、62.2%,無統(tǒng)計學差異；在6h,三組腫瘤細胞(共培養(yǎng)30d、共培養(yǎng)15d、共培養(yǎng)0d)覆蓋面積分別為71.6%、67.3%、65.5%；在12h,三組腫瘤細胞(共培養(yǎng)30d、共培養(yǎng)15d、共培養(yǎng)0d)覆蓋面積分別為88%、81.3%、68%；在24h,三組細胞(共培養(yǎng)30d、共培養(yǎng)15d、共培養(yǎng)0d)覆蓋面積分別為99.3%、91%、76.6%。由此可見,在6h、12h以及24h,經過共培養(yǎng)的腫瘤細胞覆蓋面積均大于普通培養(yǎng)的腫瘤細胞,且在每個檢測時間點共培養(yǎng)30d的腫瘤細胞覆蓋面積最大,24h后細胞覆蓋面積達99.3%。3.6普通培養(yǎng)及共培養(yǎng)30d的腫瘤細胞在順鉑、奧沙利鉑、氟尿嘧啶、伊立替康四種常用化療藥物的作用下,存活率都降低,但兩組細胞的存活率無明顯差異。3.7使用Aligent microRNA專用軟件分析掃描圖像所得數(shù)據,分別計算出兩種樣本中microRNA的標準值及比值。判斷標準：實驗組與對照組表達量比值2為表達上調,0.5則為表達下調,篩選出一組表達量上調及一組表達量下調的microRNA。4、結論4.1 CT26細胞株可以活化正常成纖維細胞,并且不依賴細胞之間的相互接觸；4.2成纖維細胞的活化狀態(tài)對CT26細胞遷移和侵襲有重要影響,但經共培養(yǎng)的CT26細胞對常見大腸癌化療藥物的耐藥性變化不大；4.3通過對腫瘤相關成纖維細胞microRNA的研究,可探討CAFs中micro RNA分子的調控對抗腫瘤轉移的影響。
【圖文】：

殖、生長、浸潤，腫瘤細胞必須與它周圍的環(huán)境因素起協(xié)同作用，這一假說為＂腫逡逑瘤微環(huán)境＂的提出奠定了基礎Ｅ２５３。腫瘤微環(huán)境由多種細胞成分及因子組成的特殊逡逑環(huán)境，為腫瘤的增殖浸潤等生物學行為提供了不可或缺物質基礎（圖２），，因此腫逡逑瘤微環(huán)境局部缺氧及酸性狀態(tài)與腫瘤血管的異常增殖，遁透性增加，及糖酵解代逡逑謝增強有關ｕａ。關于ＣＡＦｓ促進腳瘤發(fā)生發(fā)展的相關機制可Ｗ大致歸納為；ＣＡＦｓ通逡逑過分泌趨化因子、生長因子、基質金屬蛋白路從而促進血管生成和基庇膜破壞，逡逑使腫瘤細胞的轉移能力增強逡逑腫瘤基質中活化的成纖維細胞被稱作腫瘤相關成纖維細胞（ｃａｎｃｅｒ逡逑ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｆ化ｒｏｂｌａｓｔｓ，邋ＣＡＦｓ），又稱肌纖維母細胞。在大多數(shù)實體腫瘤中，腫逡逑瘤相關成纖維細胞的數(shù)量占了腫瘤間質細胞的絕大部分。雖然目前尚無可靠研究逡逑證實腫瘤成纖維細胞的來源，這一領域化飽受爭議，但是ＣＡＦｓ在巧瘤微環(huán)境中表逡逑達多種細胞因子、枯附因子、雖白w齲廡┥鏌蠐諭ü嘀滯揪洞俳裝┑膩義涎萇�，肿笼_納ぴ鮒臣敖笄ㄒ�。肿留溹关成纤维细胞促进肿笼b⑸⒄瑰義系幕頗殼吧脅磺宄�，訉扆釉嶞进一步惦y芯�。臍ぐ，有研究钡a鰨�，ＣＡＦｓ产生辶x匣式到餉父謀湎赴饣式峁勾傭俳琢魷赴窒妥

本文編號：2559580