【摘要】：背景:在實(shí)體腫瘤組織中,除大量腫瘤細(xì)胞外,還包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和免疫細(xì)胞。浸潤(rùn)到腫瘤組織的免疫細(xì)胞包括:巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)和淋巴細(xì)胞,這些免疫細(xì)胞在腫瘤組織中形成炎癥微環(huán)境,其中的巨噬細(xì)胞有助于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散,并抑制抗腫瘤免疫反應(yīng),從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。大多數(shù)腫瘤組織中都有巨噬細(xì)胞的聚集,后者通過分泌細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子和基質(zhì)降解酶,直接參與內(nèi)皮細(xì)胞的功能,并通過細(xì)胞外基質(zhì)的重建促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。目前腫瘤對(duì)各種治療方法(包括放療、化療以及抗血管藥物)呈現(xiàn)耐受狀態(tài),其可能原因是:這些治療方法均可增加腫瘤組織中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn),從而打破腫瘤微環(huán)境中促血管信號(hào)通路和抗血管信號(hào)通路之間的平衡。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)源自血液系統(tǒng)的單核細(xì)胞,在趨化因子的作用下進(jìn)入腫瘤組織分化為TAMs。腫瘤細(xì)胞分泌的集落刺激因子可延長(zhǎng)TAMs的存活時(shí)間。當(dāng)TAMs在腫瘤環(huán)境中被適度激活(即M1型)時(shí),發(fā)揮抗腫瘤免疫功能,可殺死腫瘤細(xì)胞并破壞血管內(nèi)皮,從而抑制腫瘤的發(fā)展。但是,如果這種刺激未在短時(shí)間內(nèi)受到抑制,TAMs將在腫瘤細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子的作用下極化為M2型,這也是腫瘤組織中的TAMs大多數(shù)為M2型的原因。與M1型相反,M2型TAMs的作用包括分泌生長(zhǎng)因子、血管生成因子及蛋白酶,從而刺激腫瘤細(xì)胞增殖、降解細(xì)胞外基質(zhì)、促進(jìn)血管生成和腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移,并逃脫抗腫瘤免疫的監(jiān)視。因此,誘導(dǎo)腫瘤組織中的TAMs發(fā)生二次極化,使M2型TAMs向M1型極化轉(zhuǎn)變成為近年來腫瘤治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。Endostatin是目前發(fā)現(xiàn)的最有效的血管生成抑制劑之一,可通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,抑制腫瘤血管的生成,進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。近幾年的研究發(fā)現(xiàn),除抑制血管生成外,Endostatin還具有一定的免疫學(xué)效應(yīng)。用Endostatin處理荷瘤小鼠可誘導(dǎo)大量的白細(xì)胞浸潤(rùn),并增加細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn),抑制腫瘤免疫逃逸細(xì)胞—Treg細(xì)胞的活化,提示Endostatin可增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的抗腫瘤免疫反應(yīng)。TAMs偏愛缺氧環(huán)境,常聚集于無血管區(qū)域和壞死區(qū)域。VEGF可誘導(dǎo)單核細(xì)胞到達(dá)腫瘤部位形成TAMs并極化為M2型,而TAMs自身可分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)等多種血管生長(zhǎng)因子,從而形成惡性循環(huán)。此外,胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)也可激活腫瘤中異常血管的生成,并且抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng),促進(jìn)TAM向具有促腫瘤、促血管生成功能的M2型發(fā)生極化。因此,我們推測(cè)Endostatin對(duì)腫瘤的抑制作用除了影響腫瘤血管的生成,還可通過抑制VEGF和PIGF的表達(dá)影響TAMs的極化。目的:通過轉(zhuǎn)染p Endostatin表達(dá)質(zhì)粒,上調(diào)Endostatin的表達(dá),通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察Endostatin對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響,以及Endostatin誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響,并初步探討其可能的機(jī)制。方法:體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7和骨髓巨噬細(xì)胞BMDMs,將細(xì)胞分為Control組、p Scramble組和p Endostatin組,分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和表達(dá)分泌型Endostatin的p Endostatin質(zhì)粒。MTT和HE染色方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞的增殖活性和形態(tài);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M1型和M2型相關(guān)標(biāo)記物表達(dá)陽性巨噬細(xì)胞的比例;ELISA和q RT-PCR方法檢測(cè)與巨噬細(xì)胞極化相關(guān)標(biāo)記物蛋白表達(dá)和m RNA的表達(dá)變化。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)巨噬細(xì)胞中NF-κB的活性變化;Western blot方法檢測(cè)NF-κB相關(guān)基因及其下游基因的表達(dá)變化。將小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1和黑色素瘤細(xì)胞B16分別與正常RAW264.7細(xì)胞(Control組)及轉(zhuǎn)染p Endostatin的RAW264.7細(xì)胞(M1組)共培養(yǎng)48h,重新收集4T1細(xì)胞和B16細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組:Control組和M1組。MTT和細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)觀察M1型巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖活性的影響;劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察M1型巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響;流式細(xì)胞術(shù)觀察M1型巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響;Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。構(gòu)建小鼠乳腺癌移植瘤模型,將小鼠分為Control組、PQ組、SL/p Scramble組和SL/p Endostatin組。以具有腫瘤靶向性的減毒沙門氏菌為運(yùn)載體,攜帶p Scramble和p Endostatin質(zhì)粒,以腹腔注射的方式給予小鼠,觀察并計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)指數(shù)和腫瘤指數(shù),免疫組織化學(xué)染色和掃描電鏡觀察Endostatin對(duì)腫瘤血管的影響;流式細(xì)胞術(shù)觀察TAMs中M1型和M2型的比例變化;ELISA和q RT-PCR方法觀察腫瘤中巨噬細(xì)胞極化相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)變化。結(jié)果:轉(zhuǎn)染p Endostatin表達(dá)質(zhì)粒后,RAW264.7和BMDMs細(xì)胞中Endostatin表達(dá)水平明顯上調(diào)。Endostatin表達(dá)上調(diào)可誘導(dǎo)RAW264.7和BMDMs極化為M1型巨噬細(xì)胞,增強(qiáng)細(xì)胞中NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,上調(diào)p-p65、p-STAT1的表達(dá),并下調(diào)p-STAT3、VEGF-A和PIGF的表達(dá)。Endostatin誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞可抑制4T1細(xì)胞和B16細(xì)胞的增殖活性和遷移能力,并使PCNA、MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平下降;同時(shí)它也能夠促進(jìn)B16細(xì)胞的凋亡,并上調(diào)B16細(xì)胞中c-Caspase3、c-Caspase8和Bax的表達(dá),下調(diào)Bcl-2的表達(dá),但是對(duì)4T1細(xì)胞的凋亡沒有影響;Endostatin誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞可促使4T1細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯,并上調(diào)4T1細(xì)胞中p21、CDK1和Cyclin B1的表達(dá),但對(duì)B16細(xì)胞的細(xì)胞周期未見影響。Endostatin可抑制小鼠乳腺癌移植瘤的生長(zhǎng),減少腫瘤組織中M2型TAMs的比例,增加M1型TAMs的比例;抑制腫瘤組織中VEGF-A和PIGF的表達(dá),減少腫瘤組織中的血管生成并使其形態(tài)正�；�。說明Endostatin能夠改變體內(nèi)TAMs的極化類型。結(jié)論:Endostatin表達(dá)增加可通過增強(qiáng)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性,從而影響其下游基因的表達(dá),誘導(dǎo)RAW264.7和BMDMs細(xì)胞發(fā)生M1型極化,從而抑制4T1細(xì)胞和B16細(xì)胞的增殖,使其分別發(fā)生細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。Endostatin表達(dá)增加還可通過抑制VEGF-A和PIGF的表達(dá),使TAMs向M1型極化,從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫效應(yīng)。
【圖文】：

圖 1.1 Macrophages in development, homeostasis and disease. 替代性活化的巨噬細(xì)胞（M2）M2 型巨噬細(xì)胞有免疫抑制功能，并能釋放抗炎細(xì)胞因子增強(qiáng) TH2 型它可進(jìn)一步分為四類亞型：M2a、M2b、M2c 和 M2d。Th2 型細(xì)胞因和 IL-13）能夠刺激巨噬細(xì)胞極化為 M2a 亞型，，而 TLRs 和免疫復(fù)合形成 M2b 亞型，IL-10 可誘導(dǎo)其極化為 M2c 亞型。在腫瘤中，巨噬細(xì)的主要組成部分，這種環(huán)境中的巨噬細(xì)胞被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TA研究證明：TAMs 的功能與 M2 型巨噬細(xì)胞相似，因此被認(rèn)定為 M2d 亞。M2 型巨噬細(xì)胞的特征是：IL-12lowIL-23lowIL-10high，分泌 CCL17、GF-β，并高表達(dá)甘露糖受體（CD206）和半乳糖受體，但是抗原呈遞能它的另一特點(diǎn)是精氨酸代謝發(fā)生變化：精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)轼B氨酸和多胺，氨酸酶形成瓜氨酸和 NO[16-17]。所以，M2 型可參與調(diào)節(jié)宿主的炎癥

圖 1.2 巨噬細(xì)胞的極化及其功能組織中的巨噬細(xì)胞來源于外周單核細(xì)胞，并在微環(huán)境的刺激下活化為 M1 型或者M(jìn)1 型由 LPS 和 IFN-γ 激活，能夠分泌大量的促炎因子，如 IL-6、IL-12、IL-23 和 TNM2 型根據(jù)刺激的不同分為 M2a、M2b、M2c 和 M2d 四種亞型。M2 型巨噬細(xì)胞可的 IL-10，并表達(dá)高水平的清道夫受體、甘露糖受體、IL-1 受體拮抗劑和 IL-1 誘M1 型巨噬細(xì)胞可驅(qū)動(dòng)促炎反應(yīng)和抗腫瘤反應(yīng)，激活細(xì)胞毒性。與此相反，M2 型卻促進(jìn)血管生成、免疫抑制和腫瘤生長(zhǎng)。LPS：脂多糖；IC：免疫復(fù)合物；GC：素；SR：清道夫受體；MR：甘露糖受體；IL-1ra：IL-1 受體拮抗劑；TLR：Toll MHC：主要組織相容性復(fù)合物。.4 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）循環(huán)系統(tǒng)中的單核細(xì)胞和寄居在組織中的巨噬細(xì)胞在趨化因子的作用下到腫瘤部位，從而形成腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）。腫瘤組織中巨噬細(xì)胞的
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.3

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本文編號(hào)：2556947