【摘要】：背景:在實體腫瘤組織中,除大量腫瘤細胞外,還包括成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、細胞外基質(zhì)和免疫細胞。浸潤到腫瘤組織的免疫細胞包括:巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)和淋巴細胞,這些免疫細胞在腫瘤組織中形成炎癥微環(huán)境,其中的巨噬細胞有助于腫瘤細胞的生長和擴散,并抑制抗腫瘤免疫反應(yīng),從而導(dǎo)致腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸。大多數(shù)腫瘤組織中都有巨噬細胞的聚集,后者通過分泌細胞因子、生長因子、趨化因子和基質(zhì)降解酶,直接參與內(nèi)皮細胞的功能,并通過細胞外基質(zhì)的重建促進內(nèi)皮細胞的遷移。目前腫瘤對各種治療方法(包括放療、化療以及抗血管藥物)呈現(xiàn)耐受狀態(tài),其可能原因是:這些治療方法均可增加腫瘤組織中巨噬細胞的浸潤,從而打破腫瘤微環(huán)境中促血管信號通路和抗血管信號通路之間的平衡。腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)源自血液系統(tǒng)的單核細胞,在趨化因子的作用下進入腫瘤組織分化為TAMs。腫瘤細胞分泌的集落刺激因子可延長TAMs的存活時間。當TAMs在腫瘤環(huán)境中被適度激活(即M1型)時,發(fā)揮抗腫瘤免疫功能,可殺死腫瘤細胞并破壞血管內(nèi)皮,從而抑制腫瘤的發(fā)展。但是,如果這種刺激未在短時間內(nèi)受到抑制,TAMs將在腫瘤細胞分泌的多種細胞因子的作用下極化為M2型,這也是腫瘤組織中的TAMs大多數(shù)為M2型的原因。與M1型相反,M2型TAMs的作用包括分泌生長因子、血管生成因子及蛋白酶,從而刺激腫瘤細胞增殖、降解細胞外基質(zhì)、促進血管生成和腫瘤細胞的侵襲與遷移,并逃脫抗腫瘤免疫的監(jiān)視。因此,誘導(dǎo)腫瘤組織中的TAMs發(fā)生二次極化,使M2型TAMs向M1型極化轉(zhuǎn)變成為近年來腫瘤治療的一個重要靶點。Endostatin是目前發(fā)現(xiàn)的最有效的血管生成抑制劑之一,可通過抑制內(nèi)皮細胞的增殖和遷移,抑制腫瘤血管的生成,進而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。近幾年的研究發(fā)現(xiàn),除抑制血管生成外,Endostatin還具有一定的免疫學(xué)效應(yīng)。用Endostatin處理荷瘤小鼠可誘導(dǎo)大量的白細胞浸潤,并增加細胞毒性淋巴細胞的浸潤,抑制腫瘤免疫逃逸細胞—Treg細胞的活化,提示Endostatin可增強腫瘤微環(huán)境中的抗腫瘤免疫反應(yīng)。TAMs偏愛缺氧環(huán)境,常聚集于無血管區(qū)域和壞死區(qū)域。VEGF可誘導(dǎo)單核細胞到達腫瘤部位形成TAMs并極化為M2型,而TAMs自身可分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)和成纖維細胞生長因子(FGF)等多種血管生長因子,從而形成惡性循環(huán)。此外,胎盤生長因子(PIGF)也可激活腫瘤中異常血管的生成,并且抑制T細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng),促進TAM向具有促腫瘤、促血管生成功能的M2型發(fā)生極化。因此,我們推測Endostatin對腫瘤的抑制作用除了影響腫瘤血管的生成,還可通過抑制VEGF和PIGF的表達影響TAMs的極化。目的:通過轉(zhuǎn)染p Endostatin表達質(zhì)粒,上調(diào)Endostatin的表達,通過體內(nèi)外實驗觀察Endostatin對巨噬細胞極化的影響,以及Endostatin誘導(dǎo)的巨噬細胞活化對腫瘤細胞的影響,并初步探討其可能的機制。方法:體外培養(yǎng)小鼠巨噬細胞RAW264.7和骨髓巨噬細胞BMDMs,將細胞分為Control組、p Scramble組和p Endostatin組,分別瞬時轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和表達分泌型Endostatin的p Endostatin質(zhì)粒。MTT和HE染色方法檢測巨噬細胞的增殖活性和形態(tài);流式細胞術(shù)檢測M1型和M2型相關(guān)標記物表達陽性巨噬細胞的比例;ELISA和q RT-PCR方法檢測與巨噬細胞極化相關(guān)標記物蛋白表達和m RNA的表達變化。熒光素酶報告基因檢測巨噬細胞中NF-κB的活性變化;Western blot方法檢測NF-κB相關(guān)基因及其下游基因的表達變化。將小鼠乳腺癌細胞4T1和黑色素瘤細胞B16分別與正常RAW264.7細胞(Control組)及轉(zhuǎn)染p Endostatin的RAW264.7細胞(M1組)共培養(yǎng)48h,重新收集4T1細胞和B16細胞進行以下實驗。實驗分組:Control組和M1組。MTT和細胞集落形成實驗觀察M1型巨噬細胞對腫瘤細胞增殖活性的影響;劃痕實驗和Transwell侵襲實驗觀察M1型巨噬細胞對腫瘤細胞遷移和侵襲能力的影響;流式細胞術(shù)觀察M1型巨噬細胞對腫瘤細胞凋亡和細胞周期的影響;Western blot檢測相關(guān)蛋白表達水平的變化。構(gòu)建小鼠乳腺癌移植瘤模型,將小鼠分為Control組、PQ組、SL/p Scramble組和SL/p Endostatin組。以具有腫瘤靶向性的減毒沙門氏菌為運載體,攜帶p Scramble和p Endostatin質(zhì)粒,以腹腔注射的方式給予小鼠,觀察并計算腫瘤生長指數(shù)和腫瘤指數(shù),免疫組織化學(xué)染色和掃描電鏡觀察Endostatin對腫瘤血管的影響;流式細胞術(shù)觀察TAMs中M1型和M2型的比例變化;ELISA和q RT-PCR方法觀察腫瘤中巨噬細胞極化相關(guān)標記物的表達變化。結(jié)果:轉(zhuǎn)染p Endostatin表達質(zhì)粒后,RAW264.7和BMDMs細胞中Endostatin表達水平明顯上調(diào)。Endostatin表達上調(diào)可誘導(dǎo)RAW264.7和BMDMs極化為M1型巨噬細胞,增強細胞中NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,上調(diào)p-p65、p-STAT1的表達,并下調(diào)p-STAT3、VEGF-A和PIGF的表達。Endostatin誘導(dǎo)的M1型巨噬細胞可抑制4T1細胞和B16細胞的增殖活性和遷移能力,并使PCNA、MMP-2和MMP-9的表達水平下降;同時它也能夠促進B16細胞的凋亡,并上調(diào)B16細胞中c-Caspase3、c-Caspase8和Bax的表達,下調(diào)Bcl-2的表達,但是對4T1細胞的凋亡沒有影響;Endostatin誘導(dǎo)的M1型巨噬細胞可促使4T1細胞發(fā)生G2期阻滯,并上調(diào)4T1細胞中p21、CDK1和Cyclin B1的表達,但對B16細胞的細胞周期未見影響。Endostatin可抑制小鼠乳腺癌移植瘤的生長,減少腫瘤組織中M2型TAMs的比例,增加M1型TAMs的比例;抑制腫瘤組織中VEGF-A和PIGF的表達,減少腫瘤組織中的血管生成并使其形態(tài)正�；�。說明Endostatin能夠改變體內(nèi)TAMs的極化類型。結(jié)論:Endostatin表達增加可通過增強NF-κB轉(zhuǎn)錄活性,從而影響其下游基因的表達,誘導(dǎo)RAW264.7和BMDMs細胞發(fā)生M1型極化,從而抑制4T1細胞和B16細胞的增殖,使其分別發(fā)生細胞周期阻滯和細胞凋亡。Endostatin表達增加還可通過抑制VEGF-A和PIGF的表達,使TAMs向M1型極化,從而增強抗腫瘤免疫效應(yīng)。
【圖文】：

圖 1.1 Macrophages in development, homeostasis and disease. 替代性活化的巨噬細胞（M2）M2 型巨噬細胞有免疫抑制功能，并能釋放抗炎細胞因子增強 TH2 型它可進一步分為四類亞型：M2a、M2b、M2c 和 M2d。Th2 型細胞因和 IL-13）能夠刺激巨噬細胞極化為 M2a 亞型，，而 TLRs 和免疫復(fù)合形成 M2b 亞型，IL-10 可誘導(dǎo)其極化為 M2c 亞型。在腫瘤中，巨噬細的主要組成部分，這種環(huán)境中的巨噬細胞被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TA研究證明：TAMs 的功能與 M2 型巨噬細胞相似，因此被認定為 M2d 亞。M2 型巨噬細胞的特征是：IL-12lowIL-23lowIL-10high，分泌 CCL17、GF-β，并高表達甘露糖受體（CD206）和半乳糖受體，但是抗原呈遞能它的另一特點是精氨酸代謝發(fā)生變化：精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)轼B氨酸和多胺，氨酸酶形成瓜氨酸和 NO[16-17]。所以，M2 型可參與調(diào)節(jié)宿主的炎癥

圖 1.2 巨噬細胞的極化及其功能組織中的巨噬細胞來源于外周單核細胞，并在微環(huán)境的刺激下活化為 M1 型或者M1 型由 LPS 和 IFN-γ 激活，能夠分泌大量的促炎因子，如 IL-6、IL-12、IL-23 和 TNM2 型根據(jù)刺激的不同分為 M2a、M2b、M2c 和 M2d 四種亞型。M2 型巨噬細胞可的 IL-10，并表達高水平的清道夫受體、甘露糖受體、IL-1 受體拮抗劑和 IL-1 誘M1 型巨噬細胞可驅(qū)動促炎反應(yīng)和抗腫瘤反應(yīng)，激活細胞毒性。與此相反，M2 型卻促進血管生成、免疫抑制和腫瘤生長。LPS：脂多糖；IC：免疫復(fù)合物；GC：素；SR：清道夫受體；MR：甘露糖受體；IL-1ra：IL-1 受體拮抗劑；TLR：Toll MHC：主要組織相容性復(fù)合物。.4 腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）循環(huán)系統(tǒng)中的單核細胞和寄居在組織中的巨噬細胞在趨化因子的作用下到腫瘤部位，從而形成腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）。腫瘤組織中巨噬細胞的
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.3

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本文編號：2556947