發(fā)布時(shí)間：2019-11-06 02:35

【摘要】：目的:探討RSK2在人骨肉瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義,并進(jìn)一步研究RSK2對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能影響及其相關(guān)作用機(jī)制。方法:1、收集臨床骨肉瘤手術(shù)及穿刺活檢標(biāo)本,應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)RSK2在30例骨肉瘤、15例正常瘤旁組織中(取自距腫瘤組織3cm以外)的表達(dá),并分析RSK2的表達(dá)與骨肉瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系。2、檢測(cè)RSK2基因在骨肉瘤細(xì)胞株MG-63、143B、U2-OS中的表達(dá)水平。構(gòu)建RSK2 shRNA,并應(yīng)用RT-PCR技術(shù)和Western-blot技術(shù)驗(yàn)證其干擾效果。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化情況及細(xì)胞凋亡情況。CCK8法檢測(cè)RSK2基因沉默后對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響及對(duì)化療藥物敏感性的變化。應(yīng)用裸鼠皮下成瘤技術(shù),觀察RSK2基因沉默前后成瘤能力的變化。應(yīng)用Transwell技術(shù)觀察RSK2基因沉默前后遷移能力的變化。3、應(yīng)用shRNA干擾技術(shù)沉默骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)RSK2基因表達(dá)后,用Western Blot法分別檢測(cè)三株骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)MAPK/ERK信號(hào)通路中上游分子ERK及下游分子c-Fos的表達(dá),探討骨肉瘤中RSK2在MAPK信號(hào)通路中的作用;檢測(cè)akt/mtor信號(hào)通路中關(guān)鍵分子akt及mtor的變化,探討骨肉瘤中rsk2在akt/mtor信號(hào)通路中的作用;檢測(cè)凋亡通路關(guān)鍵分子bcl2/bax/caspase-3的變化,探討骨肉瘤細(xì)胞株中rsk2shrna促凋亡的作用機(jī)制。結(jié)果:1、免疫組化結(jié)果顯示(1)30例骨肉瘤組織rsk2大部分呈高表達(dá),15例瘤旁正常肌肉組織rsk2均不表達(dá)或低表達(dá)。rsk2在骨肉瘤組織及正常瘤旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為86.67%、26.67%,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(2)rsk2的表達(dá)與骨肉瘤的大小密切相關(guān),直徑大于3cm的腫瘤rsk2表達(dá)陽(yáng)性率95%(19/20例)顯著高于直徑小于3cm的骨肉瘤的陽(yáng)性率70%(7/10例),兩者比較,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(3)rsk2在骨肉瘤組織中的表達(dá)不具有性別差異,男性陽(yáng)性率為86.67%(18/21),女性陽(yáng)性率為88.89%(8/9),兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(4)rsk2與臨床病理i、ii、iii級(jí)之間陽(yáng)性表達(dá)率分別為66.67%、90.91%與92.30%,i級(jí)與ii、iii級(jí)之間差異明顯,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。ii級(jí)和iii級(jí)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(5)rsk2與臨床分期i、ii、iii期之間陽(yáng)性表達(dá)率分別為50%、95.45%與100%,陽(yáng)性表達(dá)率與臨床分期呈正相關(guān)性,且低度惡性與高度惡性(i期與ii期)之間差異明顯,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(6)rsk2與堿性磷酸酶升高程度相關(guān),升高與未升高患者中陽(yáng)性表達(dá)率分別為91.67%、66.67%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2、rt-pcr和westernblot結(jié)果證實(shí)3種人骨肉瘤細(xì)胞株中rsk2均有明顯的表達(dá)。我們構(gòu)建的rsk2shrna可很好地沉默三株骨肉瘤細(xì)胞的rsk2的表達(dá),在mrna和蛋白水平均得到了很好地驗(yàn)證。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,rsk2shrna作用于骨肉瘤細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡率明顯的增加,以晚期凋亡增加為主。細(xì)胞周期也發(fā)生了明顯的改變,g1期阻滯明顯增加,而s、g2期比例降低。cck8法測(cè)細(xì)胞增殖曲線結(jié)果顯示,rsk2shrna作用于骨肉瘤細(xì)胞后,細(xì)胞增殖速度明顯降低。transwell結(jié)果顯示骨肉瘤細(xì)胞在rsk2shrna作用后遷移穿過(guò)transwell室間膜的能力明顯降低。裸鼠皮下移植成瘤結(jié)果顯示,rsk2作用于骨肉瘤細(xì)胞后,骨肉瘤細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤體積較正常骨肉瘤細(xì)胞明顯減小,移植瘤組織切片pcna和ki67增殖核抗原染色結(jié)果顯示,骨肉瘤細(xì)胞在rsk2shrna作用后增殖率明顯降低。cck8法測(cè)骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑及多柔比星的藥物敏感性,順鉑的半數(shù)有效抑制濃度在三株骨肉瘤細(xì)胞分別由干擾前的4.66、4.71、4.83ng/ul,降低為干擾后的3.4、3.91、3.79ng/ul,多柔比星的半數(shù)有效抑制濃度分別由干擾前的2.08、2.13、2.05ng/ul降低為術(shù)后的1.11、1.04、1.10ng/ul,rsk2shrna作用后骨肉瘤細(xì)胞對(duì)兩種藥物的半數(shù)有效濃度均明顯降低。3、與陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組相比,rsk2基因沉默后的骨肉瘤細(xì)胞株mg-63、143b、u2-os中erk及磷酸化erk蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯差異(p0.05);但c-fos蛋白表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);akt/mtor信號(hào)通路中重要的靶基因p-akt及p-mtor表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);凋亡相關(guān)信號(hào)分子Bcl2蛋白表達(dá)量明顯增加,Bax蛋白表達(dá)量明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),caspase-3表達(dá)無(wú)明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、RSK2在正常瘤旁組織中不表達(dá)或低表達(dá),在骨肉瘤組織中高表達(dá)。骨肉瘤組織中,RSK2的表達(dá)與腫瘤原發(fā)灶大小、臨床分期、病理分級(jí)及堿性磷酸酶升高程度有關(guān),但與性別、年齡無(wú)關(guān)。2、人骨肉瘤細(xì)胞中存在RSK2的表達(dá),RSK2 shRNA可有效地沉默RSK2基因的表達(dá)。降低RSK2的表達(dá)可降低骨肉瘤細(xì)胞增殖速度和移植瘤的增殖指數(shù),降低細(xì)胞遷移能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,阻滯細(xì)胞周期,增加化療藥物敏感性。3、RSK2沉默可能通過(guò)AKT/mTOR通路及Bcl2/Bax通路作用于骨肉瘤細(xì)胞。敲除RSK2可降低c-Fos的表達(dá),影響骨肉瘤細(xì)胞的功能。RSK2沉默不能逆向刺激ERK的表達(dá),也不通過(guò)caspase3影響骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。
【圖文】：

圖 1.1 骨肉瘤組織 RSK2 染色示意圖。3+代表強(qiáng)陽(yáng)性，2+代表陽(yáng)性，1+代表弱陽(yáng)性，0+代陰性。Fig.1.1 Expression of RSK2 protein in osteosarcomes. 3+ manifesting strongly positive cells, 2

骨肉瘤細(xì)胞株中RSK2mRNA的表達(dá)情況
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R738.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2556481