【摘要】：結(jié)腸癌是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,當(dāng)前以外科手術(shù)與化療為主的綜合治療效果仍不理想,治療后仍有約50%以上的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。因此,尋找新的治療靶點與治療策略以進一步改善患者預(yù)后,是目前結(jié)腸癌治療中亟需解決的問題。鈣離子(Ca2+)作為重要的第二信使參與調(diào)節(jié)許多細胞基本生理功能,并與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移和血管生成等惡性表型密切相關(guān)。細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的維持依靠細胞內(nèi)鈣庫Ca2+的釋放與細胞外Ca2+的內(nèi)流。鈣庫操縱性Ca2+內(nèi)流(store-operated calcium entry, SOCE)是Ca2+進入腫瘤細胞內(nèi)的主要方式,靶向SOCE的抑制劑有望成為新的抗腫瘤藥物。SKF-96365是鈣庫操縱性鈣內(nèi)流抑制劑,能夠明顯抑制非興奮細胞中的SOCE過程。研究發(fā)現(xiàn)SKF-96365能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖。目前,SKF-96365在結(jié)腸癌中的抗腫瘤作用及其分子機制尚不清楚。目的研究SKF-96365對結(jié)腸癌細胞的抗腫瘤作用,及對細胞周期、凋亡、自噬水平的影響；分析SKF-96365抗腫瘤作用可能的分子機制及自噬在此過程中所發(fā)揮的作用；在此基礎(chǔ)上觀察抑制自噬是否增加結(jié)腸癌細胞對SKF-96365的敏感性。方法通過激光共聚焦顯微鏡觀察SKF-96365對結(jié)腸癌細胞SOCE過程的影響；MTS檢測SKF-96365對結(jié)腸癌細胞存活的影響；流式細胞儀、Western blot等方法觀察SKF-96365對細胞周期和凋亡的影響；Western blot、免疫熒光與透射電鏡等方法觀察SKF-96365處理對結(jié)腸癌細胞自噬相關(guān)蛋白表達及自噬體形成的影響；抗體芯片及生物信息學(xué)分析SKF-96365處理后結(jié)腸癌細胞中重要信號通路的表達變化情況；MTS方法檢測,自噬抑制劑或下調(diào)自噬調(diào)控基因Beclinl抑制自噬對SKF-96365抗腫瘤作用的影響；采用流式細胞儀檢測抑制自噬前后細胞凋亡率的變化；建立結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型驗證自噬抑制劑對SKF-96365的增敏作用。結(jié)果SKF-96365能夠抑制結(jié)腸癌細胞株SOCE介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流,并能有效抑制HCT116與HT29細胞生長,其機制在于誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞G2/M期阻滯和凋亡。同時,我們發(fā)現(xiàn)SKF-96365可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞自噬,并證實SKF-96365誘導(dǎo)的自噬先于凋亡發(fā)生。自噬通過抑制細胞色素c從線粒體的釋放,從而延緩凋亡的發(fā)生,為細胞提供保護。為進一步明確SKF-96365誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞凋亡及自噬的分子機制,我們采用抗體芯片檢測SKF-96365作用前后細胞內(nèi)主要信號傳導(dǎo)通路的變化,發(fā)現(xiàn)SKF-96365能夠顯著抑制AKT/mTOR信號通路。結(jié)合生物信息學(xué)分析,我們預(yù)測并證實鈣離子-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱγ亞型(CaMKIIγ)在SKF-96365抗腫瘤過程中起到關(guān)鍵作用,其可以磷酸化AKT S473位點,進而激活A(yù)KT/mTOR信號通路。而AKT/mTOR信號通路在腫瘤增殖、凋亡及自噬過程中發(fā)揮了重要作用。過表達CaMKIIγ或AKT1,可以減弱SKF-96365誘導(dǎo)的腸癌細胞自噬與凋亡水平。體外研究表明,抑制自噬可以提高SKF-96365對結(jié)腸癌細胞的生長抑制作用。不同濃度的SKF-96365聯(lián)合自噬抑制劑CQ或3-MA作用于HCT116和HT29細胞后,對其抑制作用顯著高于SKF-96365單藥組,(p0.001)。以siRNA Beclinl轉(zhuǎn)染HCT116和HT29細胞,也能夠顯著提高腫瘤細胞對SKF-96365的敏感性。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示與SKF-96365單藥處理相比,聯(lián)合CQ和3-MA時,細胞凋亡率顯著增加(p0.05),但對于SKF-96365誘導(dǎo)的G2/M期阻滯未見明顯作用。裸鼠移植瘤結(jié)果表明自噬抑制劑HCQ可以增加SKF-96365對HCT116移植瘤的抑制作用。SKF-96365聯(lián)合HCQ組腫瘤體積較對照組縮小約48.4%,且未觀察到明顯毒性反應(yīng)。與體外研究結(jié)果一致,Western blot與免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),SKF-96365處理組微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)表達水平明顯升高。SKF-96365聯(lián)合HCQ組較SKF-96365單藥組凋亡更為明顯。同時我們進一步證實,SKF-96365抑制了腫瘤組織中CaMKIIγ/AKT/mTOR信號通路的激活。結(jié)論SKF-96365能夠明顯抑制結(jié)腸癌細胞SOCE介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流,從而抑制結(jié)腸癌細胞生長,其機制是通過抑制鈣離子/CaMKIIγ/AKT信號傳導(dǎo)通路,導(dǎo)致細胞周期阻滯、凋亡與自噬。抑制自噬促進SKF-96365在體內(nèi)外對結(jié)腸癌細胞的生長抑制作用,提高細胞凋亡率。SOCE抑制劑SKF-96365聯(lián)合自噬抑制劑有可能成為結(jié)腸癌的一種新的治療策略。
【圖文】：

胞中能夠抑制８３．７％的輯離子巧流，在ＨＴ２９中能夠抑制７１．７％的巧離子內(nèi)流。進逡逑一步通過ＭＴＳ檢測ＳＫＦ－９６３６５對結(jié)腸癌生長的抑制作用。結(jié)果表明，ＳＫＦ－９６３６５逡逑能夠Ｌ義濃度與時間依賴的方式抑制結(jié)腸癌細胞ＨＣＴ１１６和ＨＴ２９的生長（圖２），逡逑并且ＨＣＴ１１６細胞對ＳＫＦ－９６３６５的作用較為敏感，其ＩＣ５０為１０．９４Ｍ，ＨＴ２９細胞逡逑的ＩＣ５０為１４．６扣４。平扳克隆形成實驗也表明ＳＫＦ－９６３６５可１＾義明顯抑制ＨＣＴ１１６逡逑和ＨＴ２９細胞克隆形成（圖３邋）。逡逑Ａ邐ＨＣＴ１Ｉ６邐ＨＴ邋巧逡逑Ｗ邋６］邋ＯｍＭ邐２ｍＭ邋ｃＶ＊邐２ｍＭ邋ｃＶ＊逡逑５邋Ａ邐廣一—邋ＳＫＦｄｐＭ逡逑ｇ邋Ｓ邋４．邐戶—＇Ｉ邋—邋ＳＫＦＩ．洰Ｍ邋４－邐＿邋ＳＫＦＯｕＭ逡逑Ｉｓ邐b6一邋—ｓN偅耄灣位Ф擼憊螅蟈義希緬澹澹裕清巍澹櫻耍疲擔(dān)齲灣危裕緬巍澹櫻耍疲櫻椋灣義希插濉澹玻危﹀邋邋濉澹櫻耍藻澹歟浚蓿灣澹玻澹保蓿蓿掊巍澹櫻耍棋辶灣義，

本文編號：2555810