【摘要】：長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達,廣泛地參與細胞分化、個體發(fā)育等重要生物學過程,并參與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。眾多在腫瘤中發(fā)揮促癌作用或抑癌作用的lncRNA被相繼報道,提示lncRNA可作為腫瘤診斷、治療的潛在靶點。胃癌是常見的惡性腫瘤之一,世界范圍內(nèi)胃癌位居惡性腫瘤死亡率的第二位,嚴重威脅著人類的健康。胃癌的發(fā)病機制異常復雜,涉及多步驟多環(huán)節(jié)。環(huán)境因素、遺傳因素及宿主特性等在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。其中,幽門螺桿菌H.pylori(Hp)感染宿主胃粘膜被認為是胃癌的重要致癌因子。國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency For Research on Cancer,IARC)將H.pylo 列為 Ⅰ 類致癌因子,與胃癌發(fā)生顯著相關(guān)。H.pylori感染能夠引發(fā)胃粘膜慢性炎癥,歷經(jīng)不同進展期最終癌變。H.pylori感染與胃癌發(fā)病的具體分子機制尚未完全明了。本研究旨在利用高通量芯片技術(shù)篩選H.pylori感染相關(guān)胃癌中差異表達的lncRNA,對其發(fā)揮的生物學功能及分子機制進行研究,為胃癌的診斷和治療提供分子生物學基礎(chǔ)。本研究利用新鮮培養(yǎng)的H.pylori菌株感染正常人胃粘膜上皮GES-1細胞構(gòu)建H.pylori感染細胞模型。通過高通量芯片雜交技術(shù)檢測Hpylori感染模型中差異表達的lncRNA及mRNA。同時,對人正常胃粘膜組織,H.pylori陽性胃炎組織及Hpylori陽性胃癌組織進行表達譜分析。在芯片結(jié)果中,眾多與細胞周期、基因組穩(wěn)定性相關(guān)的mRNA表達水平發(fā)生顯著改變。利用生物信息學分析方法對這些與基因組穩(wěn)定性相關(guān)的mRNA與差異表達的lncRNA進行共表達網(wǎng)絡(luò)分析。根據(jù)共表達網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果,選擇lncRNA SNHG17(small nuclear RNA host gene 17)進行深入研究。首先利用 qRT-PCR 技術(shù)檢測了在正常人胃粘膜組織發(fā)展至胃癌的不同進展期中SNHG17的表達情況。結(jié)果表明,隨著感染進程的推進,SNHG17的表達水平也隨之逐漸上調(diào)。并且SNHG17在Hp陽性胃粘膜組織中的表達水平顯著高于Hp陰性組織,原位雜交實驗證實SNHG17主要定位于細胞核內(nèi)。研究SNHG17的體外功能發(fā)現(xiàn),敲低SNHG17的表達對細胞的增殖沒有明顯影響,但抑制SNHG17可使Hp感染引發(fā)的基因組DNA雙鏈斷裂顯著減少。為了探究SNHG17的體內(nèi)功能,包裝獲得可抑制SNHG17表達的慢病毒,構(gòu)建敲低SNHG17的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。通過皮下注射的方式接種裸鼠,建立裸鼠移植瘤模型,觀察對照組及實驗組細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。當實驗組及對照組細胞皮下瘤體生長至50mm3時,以10Gy劑量的電離輻射IR局部照射瘤體,繼續(xù)觀察生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNHG17敲低組細胞在電離輻射處理下,其成瘤能力顯著低于對照組。應(yīng)用免疫組織化學方法檢測兩組裸鼠腫瘤組織,發(fā)現(xiàn)SNHG17敲低組中基因組DNA雙鏈斷裂顯著減少,提示SNHG17可能通過影響基因組穩(wěn)定性對胃癌細胞的生長產(chǎn)生影響。為了研究SNHG17發(fā)揮功能的分子機制,我們利用RNA-pulldown聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)尋找在Hp感染時與SNHG17相互作用的蛋白。根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果,篩選出與SNHG17可能相互作用的蛋白 NONO(non-POU domain containing octamer-binding protein)。利用western blot實驗及RIP進行驗證,發(fā)現(xiàn)SNHG17確實能夠與NONO蛋白相互作用。利用RBPDB數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)SNHG17轉(zhuǎn)錄本第716-720位置存在NONO蛋白的結(jié)合位點,將該結(jié)合位點突變后進行RNA-pulldown實驗,發(fā)現(xiàn)NONO蛋白與SNHG17的結(jié)合能力顯著減弱,提示SNHG17在第716-720位與NONO蛋白結(jié)合。同時,GST pulldown實驗證實NONO蛋白的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域RRM1及RRM2均能夠與SNHG17結(jié)合,以上結(jié)果證實NONO蛋白可與SNHG17結(jié)合。進一步研究發(fā)現(xiàn)敲低SNHG17并不影響NONO的蛋白表達水平,NONO表達水平的改變也不影響SNHG17的表達,提示二者的結(jié)合對各自的穩(wěn)定性并無影響。在胃癌細胞中敲低NONO的表達,發(fā)現(xiàn)基因組DNA雙鏈斷裂顯著增加,DNA損傷修復蛋白Ku80顯著下降,表明NONO參與了 Hp感染過程中基因組DNA雙鏈斷裂的修復。以上結(jié)果提示SNHG17可能通過和NONO蛋白結(jié)合抑制了 Hp感染過程中的DNA損傷修復。綜上所述,本研究利用lncRNA表達譜芯片技術(shù)篩選得到與Hp感染密切相關(guān)的lncRNA SNHG17。對其功能進行深入研究,發(fā)現(xiàn)SNHG17與Hp感染引起的基因組穩(wěn)定性變化密切相關(guān)。SNHG17上存在NONO蛋白的結(jié)合位點,可與NONO蛋白直接結(jié)合。因此,通過以上研究發(fā)現(xiàn)SNHG17是在Hp感染過程中引起的關(guān)鍵lncRNA,其功能與基因組穩(wěn)定性密切相關(guān),可能成為胃癌的預防、診斷和治療的新的靶標分子。
【圖文】：

邐北京協(xié)和醫(yī)學院博士研宄生學位論文邐逡逑結(jié)果逡逑一、丨ｎｃＲＮＡ表達譜芯片篩選差異表達的ＩｎｃＲＮＡ逡逑１．建立Ｈｐ感染細胞模型逡逑為了研宄ＩｎｃＲＮＡ在Ｈｐ感染相關(guān)的胃癌中的作用，我們建立了邋Ｈｐ感染細胞逡逑模型。首先，固體培養(yǎng)基法培養(yǎng)Ｈｐ國際標準菌株（ＮＣＴＣ１１６３７）至７２ｈ時，對菌逡逑落進行革蘭氏染色及ＰＣＲ鑒定。幽門螺桿菌為革蘭氏陰性菌，呈海鷗狀、弧形或Ｓ逡逑形。結(jié)果如圖１．１Ａ所示，革蘭氏染色結(jié)果為紫色，菌落形狀為弧形或Ｓ形，證實逡逑培養(yǎng)的菌落為Ｈｐ，可用于感染實驗。接著，利用培養(yǎng)的新鮮Ｈｐ菌液以感染復數(shù)（ＭＯＩ）逡逑為１邋：邋２００的比例侵染人胃粘膜正常上皮細胞ＧＥＳ－１。侵染６ｈ后提取細胞總ＲＮＡ，逡逑ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測發(fā)現(xiàn)Ｈｐ侵染組中Ｈｐ菌株ｃａｇＡ基因表達呈陽性，ＩＬ－８表達水平顯著逡逑上調(diào)，顯示Ｈｐ感染細胞模型構(gòu)建成功（圖１．１．Ｂ）。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑

圖１．２邋ＩｎｃＲＮＡ／ｍＲＮ?
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

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