【摘要】：腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)的發(fā)現(xiàn)是腫瘤研究的里程碑,CSCs在腫瘤的靶向治療中具有潛在的應(yīng)用前景。腫瘤細(xì)胞中既包含CSCs,也包含非干性腫瘤細(xì)胞(non-Stem Cancer Cells,n SCCs),CSCs是存在于腫瘤細(xì)胞中的一小群具有異質(zhì)性的細(xì)胞。通常情況下CSCs在腫瘤細(xì)胞中所占比例不足1%,但卻決定著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥。目前已經(jīng)在多種惡性腫瘤中分離出CSCs,常規(guī)的腫瘤治療手段通常可以殺滅絕大部分的腫瘤細(xì)胞,但是難以殺滅CSCs,從而成為腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。因此腫瘤根治的關(guān)鍵是清除CSCs,因此探討針對(duì)CSCs的靶向治療手段成為目前研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。生長(zhǎng)激素/胰島素樣生長(zhǎng)因子軸在調(diào)控CSCs自我更新能力中扮演著重要角色,研究已發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中存在IGF通路的激活。通過刺激PI3K和MAPK級(jí)聯(lián)途徑,IGF1和IGF2促進(jìn)細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療及靶向治療的抵抗。在大多數(shù)正常組織中IGF2是母源印記的,僅表達(dá)父源等位基因。但是在許多腫瘤中存在這種印記表達(dá)的丟失,從而導(dǎo)致了IGF2基因的雙等位表達(dá)。研究表明這種異常高表達(dá)的IGF2加強(qiáng)了CSCs的自我更新,并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,IGF2印記丟失與腫瘤的起源密切相關(guān)。目前關(guān)于IGF2印記丟失在CSCs“干性”維持及自我更新中的作用研究較少。目的:(1)分析IGF2在CSCs中的印記丟失情況,并比較CSCs和n SCCs的印記表達(dá)差異;(2)研究IGF2印記丟失在維持CSCs干性、自我更新能力及放化療抵抗中發(fā)揮的作用;(3)探究CSCs中IGF2印記丟失的表觀調(diào)控機(jī)制。方法:(1)利用流式細(xì)胞分選技術(shù)通過CD133抗體標(biāo)記從實(shí)體腫瘤細(xì)胞分離出CSCs;(2)采用無血清懸浮培養(yǎng)法富集CSCs用于下一步印記分析等實(shí)驗(yàn);(3)通過成球?qū)嶒?yàn)、免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)CSC標(biāo)志蛋白表達(dá)測(cè)定等實(shí)驗(yàn)鑒定CSCs;(4)通過測(cè)序法研究IGF2在CSCs中的印記表達(dá)情況;(5)應(yīng)用q RT-PCR法研究CSCs中IGF2在基因水平上的表達(dá);應(yīng)用Western blotting方法研究CSCs中IGF2在蛋白水平上的表達(dá);(6)通過軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CSCs的克隆形成能力;(7)采用WST-1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)評(píng)估CSCs對(duì)放化療敏感性;(8)利用染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)(3C)研究CSCs染色質(zhì)內(nèi)部空間結(jié)構(gòu);(9)利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(Ch IP)研究IGF2的印記表達(dá)與H3K27甲基化的相關(guān)性;(10)應(yīng)用小RNA干擾的方法建立IGF2瞬時(shí)干涉細(xì)胞模型,通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期及凋亡測(cè)定、細(xì)胞遷移及侵襲試驗(yàn)等,研究IGF2在維持CSCs特性中發(fā)揮的作用。結(jié)果:(1)利用流式細(xì)胞分選技術(shù)通過CD133抗體標(biāo)記從6種實(shí)體腫瘤細(xì)胞分離出CSCs和Non-CSCs。CSCs可在干細(xì)胞培養(yǎng)基中成球培養(yǎng),連續(xù)消化傳代后仍保持與原代相同的形態(tài)特征;(2)應(yīng)用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)CSC標(biāo)志物CD133和乙醛脫氫酶(ALDH)在6種CSCs表面持續(xù)陽(yáng)性表達(dá);(3)采用流式細(xì)胞儀對(duì)分選前后的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行CD133+表達(dá)的檢測(cè),結(jié)果顯示超過90%的成球細(xì)胞為CD133陽(yáng)性;(4)通過測(cè)序法測(cè)定IGF2在CSCs中的印記表達(dá)情況,結(jié)果顯示CSCs中存在IGF2印記丟失。即使來源于IGF2印記保持細(xì)胞株的CSCs也存在IGF2印記丟失現(xiàn)象;(5)應(yīng)用q RT-PCR法研究CSCs中IGF2在基因水平上的表達(dá),結(jié)果顯示與non-CSCs相比IGF2在CSCs中的表達(dá)明顯升高;應(yīng)用Western blotting方法研究CSCs中IGF2在蛋白水平上的表達(dá),結(jié)果顯示與non-CSCs相比,IGF2在CSCs中的表達(dá)明顯升高;(6)應(yīng)用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CSCs的克隆形成能力,結(jié)果顯示CSCs中IGF2的表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致腫瘤克隆形成能力增強(qiáng);(7)采用WST-1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)評(píng)估CSCs對(duì)放化療的敏感性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與non-CSCs相比,IGF2高表達(dá)的CSCs對(duì)5-FU和奧沙利鉑的耐藥性增強(qiáng),對(duì)放療的抵抗能力增強(qiáng);(8)利用染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)(3C)檢測(cè)CSCs染色質(zhì)內(nèi)部空間結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示CSCs中的染色質(zhì)內(nèi)連接產(chǎn)物信號(hào)強(qiáng)度明顯降低;(9)利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(Ch IP)檢測(cè)了IGF2啟動(dòng)子上H3K27甲基化水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSCs中IGF2啟動(dòng)子H3K27甲基化水平明顯降低,導(dǎo)致對(duì)IGF2啟動(dòng)子的抑制作用降低;(10)應(yīng)用小RNA干擾的方法建立IGF2瞬時(shí)干涉細(xì)胞模型,研究IGF2在維持CSCs特性中發(fā)揮的作用。結(jié)果顯示:干涉IGF2基因后,CSCs中CD133+的比例明顯降低,細(xì)胞增殖受到明顯抑制,細(xì)胞周期發(fā)生改變(G2/M期細(xì)胞增多,G0/G1減少),凋亡增加,遷移和侵襲能力下降,對(duì)放化療的敏感性增強(qiáng)。結(jié)論:(1)CSCs中存在IGF2印記丟失,IGF2印記丟失可能是CSCs的標(biāo)志性特征之一;(2)CSCs中IGF2印記丟失在維持CSCs特性中發(fā)揮重要作用,并促進(jìn)了CSCs的自我更新及放化療抵抗;(3)CSCs中IGF2印記丟失與染色質(zhì)內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)消失及組蛋白H3K27甲基化這一基因表觀遺傳修飾相關(guān)。
【圖文】：

DMR/ ICR是甲基化的，CTCF不能結(jié)合，增強(qiáng)子可以作用于IGF2的啟動(dòng)子。相反，，在母源染色體中，CTCF形成了染色質(zhì)絕緣體，阻斷了激活I(lǐng)GF2的增強(qiáng)子（見下圖1.3A）。圖1.3 A. IGF2-H19基因位點(diǎn)上的印記調(diào)控示意圖[25]B. CTCF介導(dǎo)的X染色體失活中等位基因特異性抑制模型[26-28]Figure 1.3 A.Schematic diagram of regulation of imprinting on IGF2-H19 gene[25]B.Allele-specific Inhibition model in CTCF-mediated X chromosome inactivation[26-28]DMR：差異甲基化區(qū)域。Lollipops：甲基化的CpG：Xi：失活的X染色體。Xa：激活的X染色體。鼠的IGF2基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的印記基因，是等位基因特異性抑制表達(dá)的典型模型，即X染色體失活，雌性哺乳動(dòng)物的每個(gè)體細(xì)胞染色體XX中均有一個(gè)X沉默，相應(yīng)的基因量由具有XY染色體的雄性個(gè)體補(bǔ)充[23]。目前，關(guān)于IGF2印記表達(dá)和X染色體失活的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制研究較為充分，而且隨著這些研究的深入，我們逐漸發(fā)現(xiàn)在腫瘤中

失致使 IGF2 異常的高表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生、心血管疾病和腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)。心血管疾病和腫年病領(lǐng)域的地位更是極為重要，對(duì)這兩類疾病的深入研目前惡性腫瘤是人類死亡的主要元兇，據(jù)世界衛(wèi)生組織性腫瘤的人數(shù)已經(jīng)超過心血管疾病，并以逐步增長(zhǎng)的速機(jī)制及治療進(jìn)展等方面的研究意義更為重大�？椫校瑱C(jī)體精確地調(diào)節(jié)IGF2單等位基因的表達(dá)，以控制究表明，正常情況下機(jī)體準(zhǔn)確表達(dá)IGF2，在正常健康的的調(diào)控，IGF2只表達(dá)來自父源等位基因，而母源等位基常發(fā)育，這種現(xiàn)象被稱為基因組印記保持（maintenan病理情況下出現(xiàn)調(diào)控紊亂，處于印記狀態(tài)IGF2也可重新改變，稱為基因組印記丟失（圖1.4）。IGF2印記丟失從而引發(fā)多種疾病。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.2

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本文編號(hào)：2554041