【摘要】：腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)的發(fā)現(xiàn)是腫瘤研究的里程碑,CSCs在腫瘤的靶向治療中具有潛在的應用前景。腫瘤細胞中既包含CSCs,也包含非干性腫瘤細胞(non-Stem Cancer Cells,n SCCs),CSCs是存在于腫瘤細胞中的一小群具有異質性的細胞。通常情況下CSCs在腫瘤細胞中所占比例不足1%,但卻決定著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移及耐藥。目前已經(jīng)在多種惡性腫瘤中分離出CSCs,常規(guī)的腫瘤治療手段通�？梢詺缃^大部分的腫瘤細胞,但是難以殺滅CSCs,從而成為腫瘤的復發(fā)和轉移的根源。因此腫瘤根治的關鍵是清除CSCs,因此探討針對CSCs的靶向治療手段成為目前研究的重點和熱點。生長激素/胰島素樣生長因子軸在調控CSCs自我更新能力中扮演著重要角色,研究已發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中存在IGF通路的激活。通過刺激PI3K和MAPK級聯(lián)途徑,IGF1和IGF2促進細胞增殖并誘導腫瘤細胞對放化療及靶向治療的抵抗。在大多數(shù)正常組織中IGF2是母源印記的,僅表達父源等位基因。但是在許多腫瘤中存在這種印記表達的丟失,從而導致了IGF2基因的雙等位表達。研究表明這種異常高表達的IGF2加強了CSCs的自我更新,并促進腫瘤細胞的增殖,IGF2印記丟失與腫瘤的起源密切相關。目前關于IGF2印記丟失在CSCs“干性”維持及自我更新中的作用研究較少。目的:(1)分析IGF2在CSCs中的印記丟失情況,并比較CSCs和n SCCs的印記表達差異;(2)研究IGF2印記丟失在維持CSCs干性、自我更新能力及放化療抵抗中發(fā)揮的作用;(3)探究CSCs中IGF2印記丟失的表觀調控機制。方法:(1)利用流式細胞分選技術通過CD133抗體標記從實體腫瘤細胞分離出CSCs;(2)采用無血清懸浮培養(yǎng)法富集CSCs用于下一步印記分析等實驗;(3)通過成球實驗、免疫熒光染色和流式細胞術CSC標志蛋白表達測定等實驗鑒定CSCs;(4)通過測序法研究IGF2在CSCs中的印記表達情況;(5)應用q RT-PCR法研究CSCs中IGF2在基因水平上的表達;應用Western blotting方法研究CSCs中IGF2在蛋白水平上的表達;(6)通過軟瓊脂克隆形成實驗檢測CSCs的克隆形成能力;(7)采用WST-1細胞增殖實驗評估CSCs對放化療敏感性;(8)利用染色質構象捕獲技術(3C)研究CSCs染色質內部空間結構;(9)利用染色質免疫共沉淀技術(Ch IP)研究IGF2的印記表達與H3K27甲基化的相關性;(10)應用小RNA干擾的方法建立IGF2瞬時干涉細胞模型,通過細胞增殖實驗、細胞周期及凋亡測定、細胞遷移及侵襲試驗等,研究IGF2在維持CSCs特性中發(fā)揮的作用。結果:(1)利用流式細胞分選技術通過CD133抗體標記從6種實體腫瘤細胞分離出CSCs和Non-CSCs。CSCs可在干細胞培養(yǎng)基中成球培養(yǎng),連續(xù)消化傳代后仍保持與原代相同的形態(tài)特征;(2)應用免疫熒光技術發(fā)現(xiàn)CSC標志物CD133和乙醛脫氫酶(ALDH)在6種CSCs表面持續(xù)陽性表達;(3)采用流式細胞儀對分選前后的腫瘤細胞進行CD133+表達的檢測,結果顯示超過90%的成球細胞為CD133陽性;(4)通過測序法測定IGF2在CSCs中的印記表達情況,結果顯示CSCs中存在IGF2印記丟失。即使來源于IGF2印記保持細胞株的CSCs也存在IGF2印記丟失現(xiàn)象;(5)應用q RT-PCR法研究CSCs中IGF2在基因水平上的表達,結果顯示與non-CSCs相比IGF2在CSCs中的表達明顯升高;應用Western blotting方法研究CSCs中IGF2在蛋白水平上的表達,結果顯示與non-CSCs相比,IGF2在CSCs中的表達明顯升高;(6)應用軟瓊脂克隆形成實驗檢測CSCs的克隆形成能力,結果顯示CSCs中IGF2的表達上調導致腫瘤克隆形成能力增強;(7)采用WST-1細胞增殖實驗評估CSCs對放化療的敏感性,結果發(fā)現(xiàn)與non-CSCs相比,IGF2高表達的CSCs對5-FU和奧沙利鉑的耐藥性增強,對放療的抵抗能力增強;(8)利用染色質構象捕獲技術(3C)檢測CSCs染色質內部空間結構,結果顯示CSCs中的染色質內連接產(chǎn)物信號強度明顯降低;(9)利用染色質免疫共沉淀技術(Ch IP)檢測了IGF2啟動子上H3K27甲基化水平,結果發(fā)現(xiàn)CSCs中IGF2啟動子H3K27甲基化水平明顯降低,導致對IGF2啟動子的抑制作用降低;(10)應用小RNA干擾的方法建立IGF2瞬時干涉細胞模型,研究IGF2在維持CSCs特性中發(fā)揮的作用。結果顯示:干涉IGF2基因后,CSCs中CD133+的比例明顯降低,細胞增殖受到明顯抑制,細胞周期發(fā)生改變(G2/M期細胞增多,G0/G1減少),凋亡增加,遷移和侵襲能力下降,對放化療的敏感性增強。結論:(1)CSCs中存在IGF2印記丟失,IGF2印記丟失可能是CSCs的標志性特征之一;(2)CSCs中IGF2印記丟失在維持CSCs特性中發(fā)揮重要作用,并促進了CSCs的自我更新及放化療抵抗;(3)CSCs中IGF2印記丟失與染色質內環(huán)結構消失及組蛋白H3K27甲基化這一基因表觀遺傳修飾相關。
【圖文】：

DMR/ ICR是甲基化的，CTCF不能結合，增強子可以作用于IGF2的啟動子。相反，，在母源染色體中，CTCF形成了染色質絕緣體，阻斷了激活IGF2的增強子（見下圖1.3A）。圖1.3 A. IGF2-H19基因位點上的印記調控示意圖[25]B. CTCF介導的X染色體失活中等位基因特異性抑制模型[26-28]Figure 1.3 A.Schematic diagram of regulation of imprinting on IGF2-H19 gene[25]B.Allele-specific Inhibition model in CTCF-mediated X chromosome inactivation[26-28]DMR：差異甲基化區(qū)域。Lollipops：甲基化的CpG：Xi：失活的X染色體。Xa：激活的X染色體。鼠的IGF2基因是第一個被發(fā)現(xiàn)的印記基因，是等位基因特異性抑制表達的典型模型，即X染色體失活，雌性哺乳動物的每個體細胞染色體XX中均有一個X沉默，相應的基因量由具有XY染色體的雄性個體補充[23]。目前，關于IGF2印記表達和X染色體失活的表觀遺傳調控機制研究較為充分，而且隨著這些研究的深入，我們逐漸發(fā)現(xiàn)在腫瘤中

失致使 IGF2 異常的高表達，進而導致多種疾病的發(fā)生、心血管疾病和腫瘤的發(fā)病密切相關。心血管疾病和腫年病領域的地位更是極為重要，對這兩類疾病的深入研目前惡性腫瘤是人類死亡的主要元兇，據(jù)世界衛(wèi)生組織性腫瘤的人數(shù)已經(jīng)超過心血管疾病，并以逐步增長的速機制及治療進展等方面的研究意義更為重大�？椫�，機體精確地調節(jié)IGF2單等位基因的表達，以控制究表明，正常情況下機體準確表達IGF2，在正常健康的的調控，IGF2只表達來自父源等位基因，而母源等位基常發(fā)育，這種現(xiàn)象被稱為基因組印記保持（maintenan病理情況下出現(xiàn)調控紊亂，處于印記狀態(tài)IGF2也可重新改變，稱為基因組印記丟失（圖1.4）。IGF2印記丟失從而引發(fā)多種疾病。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.2

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本文編號：2554041