【摘要】：背景與目的:近年來(lái),盡管肺癌的檢查和治療手段取得了巨大進(jìn)步,但其死亡率一直高居不下,肺癌仍然是人類(lèi)目前死亡率最高的腫瘤之一,原因之一是治療后的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及治療的耐藥性不能很好的解決。腫瘤干細(xì)胞(CSCs)是腫瘤細(xì)胞群體中一小部分具有自我更新及多向分化能力,并且具有高度的侵襲和轉(zhuǎn)移能力等特性的細(xì)胞。CSCs學(xué)說(shuō)認(rèn)為肺癌干細(xì)胞(LCSC)參與肺癌的癌變、發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤耐藥、以及腫瘤的復(fù)發(fā)等各個(gè)過(guò)程。另有研究發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)同樣能夠增加腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,并且可以增加腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性,這也許是兩者關(guān)系密切的重要證據(jù)。尼古丁作為煙草中重要化學(xué)物質(zhì),能夠誘導(dǎo)包括肺癌在內(nèi)的多種人類(lèi)癌細(xì)胞的EMT和促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移。尼古丁誘導(dǎo)侵襲和EMT的過(guò)程可能是肺癌發(fā)生耐藥和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制,可能對(duì)肺癌干細(xì)胞能夠產(chǎn)生同樣的作用。闡明EMT相關(guān)信號(hào)通路與LCSC相互作用機(jī)制,有望為吸煙肺癌患者的后續(xù)治療開(kāi)辟新途徑。本研究目的主要是富集肺癌干細(xì)胞,檢測(cè)其干細(xì)胞特性,并探索尼古丁誘導(dǎo)的EMT對(duì)肺癌干細(xì)胞的作用,為后續(xù)進(jìn)一步分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。材料與方法:(1)以人肺腺癌A549細(xì)胞株為研究對(duì)象;(2)應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)研究不同濃度尼古丁對(duì)肺癌細(xì)胞株遷移和侵襲能力的作用;(3)通過(guò)使用Real-time PCR和Western blot方法研究尼古丁對(duì)肺癌細(xì)胞EMT相關(guān)表面標(biāo)志物m RNA和蛋白水平的影響;(4)通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)尼古丁誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞EMT,發(fā)生β-catenin蛋白表達(dá)核轉(zhuǎn)移;(5)使用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法富集肺癌細(xì)胞球細(xì)胞;(6)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)側(cè)群細(xì)胞(SP)在細(xì)胞球細(xì)胞和親代肺癌細(xì)胞間的含量差異;(7)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133在細(xì)胞球細(xì)胞和親代肺癌細(xì)胞中表達(dá)差異;(8)應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞球細(xì)胞和親代肺癌細(xì)胞株中ABCG2和CD133的m RNA表達(dá)水平差異,Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞球細(xì)胞和親代肺癌細(xì)胞株中ABCG2蛋白表達(dá)差異;(9)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞球細(xì)胞和親代肺癌細(xì)胞株中的細(xì)胞周期差異;(10)應(yīng)用CCK8法測(cè)定順鉑對(duì)肺癌細(xì)胞球細(xì)胞和親代肺癌細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度(IC50),繪制濃度-抑制率回歸曲線(xiàn);(11)應(yīng)用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)比較細(xì)胞球細(xì)胞和親代肺癌細(xì)胞株體外侵襲能力差異;(12)應(yīng)用Real-time PCR和Western blot方法研究尼古丁對(duì)細(xì)胞球細(xì)胞EMT相關(guān)表面標(biāo)志物m RNA和蛋白水平的影響;(13)通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)研究尼古丁對(duì)細(xì)胞球細(xì)胞侵襲能力的影響;結(jié)果:(1)0.1、1、10μmol/L尼古丁處理肺癌細(xì)胞株24h、48h后進(jìn)入劃痕區(qū)域細(xì)胞數(shù)量較0μmol/L組顯著增多,劃痕區(qū)域面積明顯縮小,經(jīng)方差分析尼古丁處理組遷移能力顯著高于未處理組(P=0.000)。(2)1μmol/L和0μmol/L尼古丁處理細(xì)胞后,Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)穿過(guò)基底膜的肺癌細(xì)胞數(shù)量為:106±2和67±2,尼古丁處理組細(xì)胞侵襲能力顯著增強(qiáng)(P=0.000)。(3)尼古丁處理肺癌細(xì)胞株48h后,E-cadherin表達(dá)下調(diào),Vimentin表達(dá)上調(diào)。0.1、1、10μmol/L尼古丁處理的肺癌細(xì)胞后,E-cadherin m RNA表達(dá)(0.81±0.03,0.49±0.01,0.39±0.05)低于未處理組細(xì)胞(1.00±0.12),與未處理組E-cadherin m RNA表達(dá)水平的2-ΔΔCT值比較有顯著性差異(P=0.000,0.000,0.000);0.1、1、10μmol/L尼古丁處理肺癌細(xì)胞后,Vimentin m RNA表達(dá)(1.64±0.07,2.03±0.06,2.35±0.10)明顯高于未處理組細(xì)胞(1.00±0.12),與未處理組Vimentin m RNA表達(dá)水平的2-ΔΔCT值比較有顯著性差異(P=0.000,0.000,0.000);0.1、1、10μmol/L尼古丁處理后,E-cadherin蛋白表達(dá)(0.27±0.002,0.25±0.005,0.18±0.003)低于未處理組細(xì)胞(0.30±0.003),與未處理組E-cadherin蛋白表達(dá)水平的灰度比值比較有顯著性差異(P=0.000,0.000,0.000);0.1、1、10μmol/L尼古丁處理后,Vimentin蛋白表達(dá)(0.52±0.008,0.86±0.005,1.14±0.010)高于未處理組細(xì)胞(0.37±0.005),與未處理組Vimentin蛋白表達(dá)水平的灰度比值比較有顯著性差異(P=0.022,0.000,0.000);1μmol/L尼古丁處理24,48,72h的肺癌細(xì)胞組E-cadherin蛋白表達(dá)(0.47±0.009,0.31±0.008,0.23±0.003)低于未處理組細(xì)胞(0.69±0.001),與未處理組E-cadherin蛋白表達(dá)水平的灰度比值比較有顯著性差異(P=0.000,0.000,0.000);1μmol/L尼古丁處理24,48,72h的肺癌細(xì)胞組Vimentin蛋白表達(dá)(0.09±0.003,0.32±0.003,0.40±0.003)高于未處理組細(xì)胞(0.06±0.002),與未處理組Vimentin蛋白表達(dá)水平的灰度比值比較有顯著性差異(P=0.002,0.000,0.000);(4)1μmol/L尼古丁處理肺癌細(xì)胞48h后,免疫熒光檢測(cè)顯示β-catenin蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)移。(5)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)能夠形成細(xì)胞球細(xì)胞,且細(xì)胞球可穩(wěn)定傳代。(6)細(xì)胞球細(xì)胞SP陽(yáng)性比例(12.36±1.47%)顯著高于親代肺癌細(xì)胞(5.79±0.11%),兩組間SP表達(dá)比較具有顯著性差異(P=0.000)。(7)細(xì)胞球細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133表達(dá)(15.90±0.32%)顯著高于親代肺癌細(xì)胞(0.40±0.02%),兩組間CD133表達(dá)比較具有顯著性差異(P=0.000)。(8)細(xì)胞球細(xì)胞CD133 m RNA表達(dá)(1.45±0.02)顯著高于親代細(xì)胞(1.00±0.07),兩組間CD133 m RNA表達(dá)水平的2-ΔΔCT值比較有顯著性差異(P=0.001)。(9)細(xì)胞球細(xì)胞ABCG2 m RNA表達(dá)(1.48±0.05)顯著高于親代細(xì)胞(1.00±0.05),兩組間ABCG2 m RNA表達(dá)水平的2-ΔΔCT值比較有顯著性差異(P=0.000);細(xì)胞球細(xì)胞ABCG2蛋白表達(dá)(0.75±0.001)顯著高于親代細(xì)胞(0.20±0.004),兩組間ABCG2蛋白表達(dá)水平的灰度比值比較有顯著性差異(P=0.000)。(10)細(xì)胞球細(xì)胞和親代肺癌細(xì)胞株的細(xì)胞周期分布經(jīng)F檢驗(yàn)有顯著性差異(P=0.000)。細(xì)胞周期兩兩比較:細(xì)胞球細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞含量(79.55±1.63%)顯著高于親代肺癌細(xì)胞(53.15±2.19%),兩組間比較具有顯著性差異(P=0.005);細(xì)胞球細(xì)胞G2/M期細(xì)胞含量(18.85±1.48%)與親代細(xì)胞(19.75±4.03%),兩組比較無(wú)明顯差異(P=0.795);細(xì)胞球細(xì)胞S期細(xì)胞含量(1.62±0.06%)顯著低于親代細(xì)胞(27.15±1.91%),兩組間比較具有顯著性差異(P=0.003)。(11)細(xì)胞球細(xì)胞對(duì)DDP的IC50值(7.07±0.85μg/L)顯著高于親代細(xì)胞(2.25±0.35μg/L),兩組細(xì)胞對(duì)DDP 48h的IC50值比較有顯著性差異(P=0.000)。(12)細(xì)胞球細(xì)胞和親代肺癌細(xì)胞株Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)量分別為:85±4和67±2,細(xì)胞球組穿過(guò)基底膜細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P=0.001)。(13)肺癌細(xì)胞球細(xì)胞經(jīng)尼古丁處理后EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào),Vimentin表達(dá)上調(diào)。1μmol/L尼古丁處理48h的肺癌細(xì)胞組E-cadherin m RNA表達(dá)(0.60±0.02)低于未處理組細(xì)胞(1.00±0.12),兩組間E-cadherin m RNA表達(dá)水平的2-ΔΔCT值比較有顯著性差異(P=0.000);1μmol/L尼古丁處理處理48h的肺癌細(xì)胞組Vimentin m RNA表達(dá)(1.21±0.03)高于未處理組細(xì)胞(1.00±0.03),兩組間Vimentin m RNA表達(dá)水平的2-ΔΔCT值比較有顯著性差異(P=0.001);0.1、1、10μmol/L尼古丁處理后,E-cadherin蛋白表達(dá)(0.55±0.030,0.40±0.011,0.22±0.014)低于未處理組細(xì)胞(0.79±0.008),與未處理組E-cadherin蛋白表達(dá)水平的灰度比值比較有顯著性差異(P=0.000,0.000,0.000);0.1、1、10μmol/L尼古丁處理后,Vimentin蛋白表達(dá)(0.18±0.009,0.43±0.011,0.54±0.002)高于未處理組細(xì)胞(0.15±0.002),與未處理組Vimentin蛋白表達(dá)水平的灰度比值比較有顯著性差異(P=0.022,0.000,0.000);1μmol/L尼古丁處理24,48,72h的肺癌細(xì)胞組E-cadherin蛋白表達(dá)(0.39±0.005,0.34±0.004,0.26±0.005)低于未處理組細(xì)胞(0.53±0.008),與未處理組E-cadherin蛋白表達(dá)水平的灰度比值比較有顯著性差異(P=0.000,0.000,0.000);1μmol/L尼古丁處理24,48,72h的肺癌細(xì)胞組Vimentin蛋白表達(dá)(0.17±0.002,0.22±0.003,0.25±0.002)高于未處理組細(xì)胞(0.13±0.006),與未處理組Vimentin蛋白表達(dá)水平的灰度比值比較有顯著性差異(P=0.004,0.000,0.000);(14)1μmol/L和0μmol/L尼古丁處理細(xì)胞球細(xì)胞后,Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)量為:140±8和85±4,1μmol/L細(xì)胞球組數(shù)量顯著增多(P=0.000)。結(jié)論:(1)尼古丁處理肺癌細(xì)胞后從表面標(biāo)志物表達(dá)水平和生物學(xué)行為上均表現(xiàn)出明顯EMT現(xiàn)象,侵襲能力呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴(lài)性顯著增強(qiáng);(2)通過(guò)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)得到肺癌細(xì)胞球細(xì)胞具有顯著增強(qiáng)的自我更新、增殖、分化、耐藥及體外侵襲遷移能力,細(xì)胞球細(xì)胞多處于細(xì)胞周期靜止期,高表達(dá)ABCG2基因,并顯著高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物,細(xì)胞球細(xì)胞可作為肺癌干細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);(3)尼古丁可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞球細(xì)胞即肺癌干細(xì)胞EMT,促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移。
【圖文】：

理后A549細(xì)胞進(jìn)入劃痕區(qū)域細(xì)胞數(shù)量較0μmol/L組顯著增多，，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。不同濃度尼古丁處理后能夠增強(qiáng)A549細(xì)胞遷移能力，并呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴(lài)性提高細(xì)胞遷移能力(圖1.1，表1.7)。

圖1.2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) A：對(duì)照組；B： 尼古丁處理組(×200)表1.8 尼古丁處理組和普通細(xì)胞侵襲能力比較尼古丁濃度（μmol/L） 穿過(guò)基底膜細(xì)胞數(shù)量（個(gè)） P0 67±20.0001 106±23 尼古丁對(duì)肺癌細(xì)胞 EMT 相關(guān) mRNA 表達(dá)的影響（1）細(xì)胞總 RNA 檢測(cè)測(cè)定所有細(xì)胞總RNA濃度及其OD 260/280比例均在1.8～2.0之間(最佳范圍.6-2.1)，細(xì)胞所提取RNA純度較高（表1.9）。A B
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2549565