【摘要】：胃癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,發(fā)病率位居惡性腫瘤發(fā)病率第四位,且具有很高的致死率。我國(guó)的胃癌死亡病例占全球胃癌死亡總數(shù)的40%。胃癌患者的預(yù)后不良,即使是經(jīng)根治性切除手術(shù)治療聯(lián)合化學(xué)治療的胃癌患者其五年生存率僅為35-40%。這一結(jié)果可能是由胃癌的異質(zhì)性和非個(gè)體臨床治療導(dǎo)致的。相較于傳統(tǒng)的腫瘤治療方法,腫瘤靶向治療將腫瘤的治療帶入一個(gè)嶄新的階段,研究探尋新的并且有效的腫瘤生物靶點(diǎn)成為近年來國(guó)際上腫瘤靶向治療的熱點(diǎn)之一。micro RNAs(mi RNAs)是一種長(zhǎng)度在21-25nt的單鏈非編碼RNA,通過與靶基因3′非編碼區(qū)(untranslate dregions,UTR)的相互結(jié)合降解靶基因m RNA或是抑制靶基因m RNA的表達(dá),發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用。mi RNAs能夠調(diào)節(jié)大約30%m RNAs,具有強(qiáng)大的生物學(xué)功能。近年來大量研究發(fā)現(xiàn),mi RNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著極其重要的作用。因此,mi RNAs極有可能成為腫瘤靶向治療的靶點(diǎn)之一。mi R-200家族根據(jù)種子區(qū)域核苷酸序列不同分成mi R-200a,-200b,-200c,-141和-429五個(gè)成員,他們成簇表達(dá),轉(zhuǎn)錄為兩個(gè)多順反子的原始mi RNA轉(zhuǎn)錄物mi R-200b-200a-429和mi R-200c-141,分別位于人第1(1p36.33)和12(12p13.31)常染色體上。mi R-200家族在多種腫瘤中的表達(dá)存在異常,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。但是已有研究結(jié)果表明,在不同的組織中mi R-200家族的表達(dá)、功能及其調(diào)控機(jī)制存在差異甚至相反。mi R-200家族至今未被作為重要的生物治療靶點(diǎn)在胃癌中進(jìn)行深入研究,其家族成員在胃癌中的表達(dá)、功能和調(diào)節(jié)機(jī)制依然不是很清楚。本研究采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,q RT-PCR)檢測(cè)mi R-200家族五個(gè)成員在胃癌組織和其配對(duì)癌旁非癌組織中的表達(dá),同時(shí)檢測(cè)胃癌細(xì)胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823、HGC-27和胃上皮細(xì)胞株GES-1中mi R-200c和mi R-141的表達(dá),深入分析mi R-200c和mi R-141的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征、無病生存期(disease-free survival,DFS)及腫瘤標(biāo)記物CA50、CEA、CA199和CA724的關(guān)系。單獨(dú)或同時(shí)進(jìn)行mi R-200c和mi R-141的過表達(dá)或沉默,并通過CCK-8(Cell-Counting Kit-8 assay)實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)研究mi R-200c和mi R-141對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響,利用雙熒光素酶報(bào)告基因分析檢測(cè)mi R-200c和mi R-141對(duì)其預(yù)測(cè)靶基因E盒結(jié)合鋅指蛋白-1、-2(zinc finger E-box-binding homeobox 1/2,ZEB1/2)的靶向作用,采用q RT-PCR和Western-blot檢測(cè)胃癌細(xì)胞株SGC-7901中mi R-200c和mi R-141對(duì)其預(yù)測(cè)靶基因ZEB1/2及ZEB1/2的抑制基因E-cadherin的影響。同時(shí)檢測(cè)胃癌組織和其配對(duì)癌旁非癌組織中mi R-200c和mi R-141預(yù)測(cè)靶基因ZEB1和ZEB2的表達(dá)情況,分析其與mi R-200c和mi R-141表達(dá)水平的關(guān)系。利用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換-甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(Bisulfite conversion-specific and methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)和q RT-PCR技術(shù)檢測(cè)胃癌組織和其配對(duì)癌旁非癌組織中mi R-200c/141簇上游Cp G島的甲基化水平及TGF-β的表達(dá)情況,分析其與mi R-200c和mi R-141表達(dá)水平的關(guān)系。采用q RT-PCR技術(shù)檢測(cè)TGF-β和去甲基化抗腫瘤藥物地西他濱(5-aza-2′-deoxycytidine,5-Ad C)對(duì)mi R-200c和mi R-141在胃癌細(xì)胞株SGC-7901中表達(dá)的影響。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:第一部分mi R-200家族在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)及其與臨床病理特征和DFS的關(guān)系目的:通過檢測(cè)mi R-200家族在胃癌組織和配對(duì)癌旁非癌組織中的表達(dá),以及在四種胃癌細(xì)胞系和一種正常胃上皮細(xì)胞系中的表達(dá),探討其在胃癌中的表達(dá)情況及其與胃癌患者臨床病理特征及DFS的關(guān)系。方法:采用q RT-PCR技術(shù)檢測(cè)mi R-200家族在胃癌組織和配對(duì)癌旁非癌組織中的表達(dá),檢測(cè)mi R-200c和mi R-141在四種胃癌細(xì)胞系和一種正常胃上皮細(xì)胞系中的表達(dá)情況�；仡櫺苑治銎浔磉_(dá)水平與胃癌患者的臨床病理特征及DFS的相關(guān)性。胃癌患者的臨床病理特征包括患者年齡、性別、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤TNM分期、腫瘤侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、脈管瘤栓情況。另外,分析了mi R-200c和mi R-141表達(dá)與胃癌患者腫瘤標(biāo)記物CA50、CEA、CA199和CA724表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果1 mi RNA-200家族在胃癌組織和配對(duì)的癌旁非癌組織中的表達(dá)水平。64例胃癌標(biāo)本中,mi R-200a,mi R-200b,mi R-200c,mi R-141和mi R-429的表達(dá)下調(diào)率分別是53.13%(34/64),48.44%(31/64),78.13%(50/64),76.19(48/63,1例數(shù)據(jù)丟失)和50.00%(32/64)。與配對(duì)癌旁非癌組織相比,mi R-200c和mi R-141在胃癌組織中的表達(dá)顯著降低(P0.001,P0.001),mi R-200a,mi R-200b和mi R-429的表達(dá)沒有顯著差異(P=0.258,P=0.501,P=0.870)。另外,mi R-200c和mi R-141的表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.840,P0.001)。2 mi R-200c和mi R-141在胃癌細(xì)胞系及正常胃上皮細(xì)胞系中的表達(dá)情況。與正常胃上皮細(xì)胞GES-1相比,mi R-200c在胃癌細(xì)胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823和HGC-27中的表達(dá)顯著降低(P=0.003,P=0.003,P=0.002,P=0.008);mi R-141在胃癌細(xì)胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823和HGC-27中的表達(dá)亦顯著降低(P=0.001,P=0.002,P=0.001,P0.001)。3胃癌組織中mi R-200c和mi R-141的表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的相關(guān)性。63例胃癌患者中,mi R-200c的表達(dá)水平與腫瘤TNM分期、腫瘤侵襲深度、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況及脈管瘤栓情況存在顯著相關(guān)性(P=0.021,P=0.008,P=0.001,P=0.050),與患者性別、年齡、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況沒有顯著相關(guān)性(P=0.062,P=0.906,P=0.218,P=0.139)。采用多元線性回歸(multiple linear regression)的方法綜合分析腫瘤TNM分期、腫瘤侵襲深度、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況及脈管瘤栓對(duì)mi R-200c表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)腫瘤TNM分期、腫瘤侵潤(rùn)深度與脈管瘤栓與mi R-200c的表達(dá)存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(Beta=-0.424,-0.219,-0.453;t=-2.687,-1.398,-3.003;P=0.004,0.009,0.001)。mi R-141的表達(dá)水平與腫瘤侵襲深度存在顯著相關(guān)性(P=0.004),與患者性別、年齡、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、脈管瘤栓情況沒有顯著相關(guān)性(P=0.937,P=0.444,P=0.373,P=0.160,P=0.172,P=0.057,P=0.630)。另外,mi R-141的表達(dá)水平與外周血中CA-724的水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.258,P=0.047)。4胃癌組織中mi R-200c和mi R-141的表達(dá)與胃癌患者DFS的相關(guān)性。63例胃癌患者中,mi R-200c高表達(dá)組與低表達(dá)的中位DFS為22.0(月)和13.5(月),mi R-141高表達(dá)組與低表達(dá)的中位DFS為21.3(月)和13.5(月)。mi R-200c和mi R-141的表達(dá)水平與患者DFS呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P=0.002和P=0.012)。結(jié)論1 mi R-200c和mi R-141在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于配對(duì)癌旁非癌組織,而其他mi R-200家族成員沒有顯著變化中。與正常胃上皮細(xì)胞GES-1相比,mi R-200c和mi R-141的表達(dá)在4株胃癌細(xì)胞株也顯著降低。提示mi R-200c和mi R-141可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。2胃癌組織中mi R-200c和mi R-141表達(dá)與腫瘤侵潤(rùn)深度與脈管瘤栓情況存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,提示mi R-200c和mi R-141可能在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用。3 mi R-200c和mi R-141可能成為胃癌預(yù)后的潛在提示指標(biāo)。第二部分mi R-200c和mi R-141對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制目的:探討mi R-200c和mi R-141在胃癌中的功能及其發(fā)揮功能的機(jī)制。方法:單獨(dú)或共同轉(zhuǎn)染mi R-200c和mi R-141模擬物或是抑制物或是陰性對(duì)照,通過CCK-8、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察mi R-200c和mi R-141在胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用。運(yùn)用Micro RNA生物信息學(xué)網(wǎng)站和軟件,對(duì)其可能的作用靶序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,結(jié)合mi R-200c和mi R-141在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮的生物學(xué)功能,進(jìn)行進(jìn)一步篩選。通過雙熒光素酶報(bào)告基因分析的方法檢測(cè)對(duì)其預(yù)測(cè)靶基因靶向作用,采用q RT-PCR和Western-blot檢測(cè)胃癌細(xì)胞株SGC-7901中mi R-200c/141簇對(duì)其預(yù)測(cè)靶基因的影響。同時(shí)檢測(cè)胃癌組織和其配對(duì)癌旁非癌組織中mi R-200c/141預(yù)測(cè)靶基因的表達(dá)情況,分析其與mi R-200c和mi R-141表達(dá)水平的關(guān)系。結(jié)果1 mi R-200c或(和)mi R-141對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞增殖能力的影響。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞48小時(shí)后,All Stars Negative Control si RNA轉(zhuǎn)染組(陰性對(duì)照組)、mi R-200c mimic轉(zhuǎn)染組、mi R-200c Inhibitor轉(zhuǎn)染組、mi R-141mimic轉(zhuǎn)染組、mi R-141Inhibitor轉(zhuǎn)染組、,mi R-200c/141 mimic轉(zhuǎn)染組和mi R-200c/141 Inhibitor轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.859,0.057,0.103,0.100,0.094,0.072,0.141)。mi R-200c和mi R-141對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞的增殖沒有明顯影響。2 mi R-200c或(和)mi R-141對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,劃痕24小時(shí)后,與空白對(duì)照組相比,mi R-200c mimic轉(zhuǎn)染組和mi R-141mimic轉(zhuǎn)染組劃痕愈合比例降低,但統(tǒng)計(jì)學(xué)沒有顯著差異(P=0.073,0.202)。mi R-200c Inhibitor轉(zhuǎn)染組和mi R-141 Inhibitor轉(zhuǎn)染組劃痕愈合比例增加,但統(tǒng)計(jì)學(xué)沒有顯著差異(P=0.130,0.066);mi R-200c/141 mimics共同轉(zhuǎn)染組24小時(shí)后劃痕愈合比例明顯降低(P0.001)。相應(yīng)的,mi R-200c/141 Inhibitor共同轉(zhuǎn)染組24小時(shí)后劃痕愈合比例明顯增加(P0.001)。Transwell實(shí)驗(yàn)亦得出相符結(jié)果,與空白對(duì)照組相比,mi R-200c mimic轉(zhuǎn)染組和mi R-141mimic轉(zhuǎn)染組24小時(shí)后每個(gè)視野下穿過細(xì)胞數(shù)減少,但統(tǒng)計(jì)學(xué)沒有顯著差異(P=0.302,0.872);mi R-200c Inhibitor轉(zhuǎn)染組和mi R-141Inhibitor轉(zhuǎn)染組24小時(shí)后每個(gè)視野下穿過細(xì)胞數(shù)增大,但統(tǒng)計(jì)學(xué)沒有顯著差異(P=0.089,0.057);mi R-200c/141 mimics共同轉(zhuǎn)染組24小時(shí)后每個(gè)視野下穿過細(xì)胞數(shù)明顯減少(P0.001)。相應(yīng)的,mi R-200c/141Inhibitor共同轉(zhuǎn)染組24小時(shí)后每個(gè)視野下穿過細(xì)胞數(shù)明顯增加(P0.001)。mi R-200c和mi R-141抑制人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。3雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證ZEB1和ZEB2為mi R-200c/-141的共同靶基因。雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果顯示,共同轉(zhuǎn)移mi R-200c/141 mimics能夠顯著降低ZEB1和ZEB2的相對(duì)熒光強(qiáng)度(P0.001,P=0.001),而單獨(dú)轉(zhuǎn)染mi R-200c或是mi R-141 mimics能夠降低ZEB1和ZEB2的相對(duì)熒光強(qiáng)度,但統(tǒng)計(jì)學(xué)沒有顯著性差異。4在胃癌細(xì)胞株SGC-7901中過表達(dá)mi R-200c/141對(duì)ZEB1/2和E-cadherin表達(dá)的影響。mi R-200c/141 mimics共同轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC-7901后,ZEB1和ZEB2m RNA和蛋白的表達(dá)水平顯著降低,E-cadherin表達(dá)水平顯著升高。相應(yīng)地,共同轉(zhuǎn)染mi R-200c/141抑制物后,ZEB1和ZEB2 m RNA和蛋白的表達(dá)水平顯著升高,E-cadherin表達(dá)水平顯著降低。5 ZEB1/2在胃癌中的表達(dá)情況及其與mi R-200c/141的關(guān)系。64例胃癌標(biāo)本中,ZEB1和ZEB2的表達(dá)上調(diào)率都是68.75%(44/64)。相較于配對(duì)癌旁非癌組織,ZEB1和ZEB2在胃癌組織中的表達(dá)顯著升高(P=0.001;P=0.004)。ZEB1的表達(dá)水平與mi R-200c表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.273,P=0.029),ZEB2的表達(dá)水平與mi R-200c和mi R-141的表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.426,-0.494;P=0.001,0.001)。結(jié)論1 mi R-200c/141可抑制胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。2在胃癌細(xì)胞株SGC-7901中,mi R-200c/141通過靶向抑制ZEB1和ZEB2的表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)E-cadherin的表達(dá)升高來發(fā)揮其抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。3在胃癌患者中mi R-200c/141可能是通過ZEB1和(或)ZEB2途徑調(diào)控胃癌的發(fā)展。第三部分TGF-β和mi R-200c/141 Cp G島甲基化水平對(duì)mi R-200c/141目的:通過檢測(cè)胃癌組織和配對(duì)癌旁非癌組織中TGF-β的表達(dá)水平和mi R-200c/141 Cp G島甲基化水平,探討其與mi R-200c和mi R-141表達(dá)水平的相關(guān)性。方法:采用q RT-PCR技術(shù)從轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)TGF-β在胃癌組織和配對(duì)癌旁非癌組織中的表達(dá);運(yùn)用MSP方法檢測(cè)胃癌組織和配對(duì)癌旁非癌組織中mi R-200c/141 Cp G島的甲基化水平。分析TGF-β表達(dá)水平及mi R-200c/141 Cp G島的甲基化水平與mi R-200c和mi R-141水平的相關(guān)性。地西他濱和(或)TGF-β處理胃癌細(xì)胞株SGC-7901,觀察其對(duì)mi R-200c和mi R-141表達(dá)的影響。結(jié)果1 TGF-β在胃癌中的表達(dá)情況及其與mi R-200c/141的相關(guān)性。63例胃癌標(biāo)本中,TGF-β的表達(dá)上調(diào)率都是66.67%(42/63)。與配對(duì)癌旁非癌組織相比,TGF-β在胃癌組織中的表達(dá)顯著升高(Median:0.84,2.50,Interquartile Range:0.42,2.43,P=0.005)。TGF-β的表達(dá)水平與mi R-200c和mi R-141的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.364,-0.526;P=0.003,0.001)。2胃癌中mi R-200c/141 Cp G島的甲基化水平及其與mi R-200c/141的相關(guān)性。63例胃癌標(biāo)本中,mi R-200c/141 Cp G島的甲基化升高率為84.13%(53/63)。與配對(duì)癌旁非癌組織相比,mi R-200c/141 Cp G島的甲基化水平在胃癌組織中顯著升高(Median:0.39,0.68,Interquartile Range:0.16,0.30,P0.001)。mi R-200c/141 Cp G島的甲基化水平與mi R-200c和mi R-141的水平呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.303,-0.522;P=0.016,0.001)。3 TGF-β與地西他濱對(duì)SGC-7901細(xì)胞中mi R-200c和mi R-141表達(dá)的影響。TGF-β誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株SGC-7901中mi R-200c和mi R-141表達(dá)顯著降低(P=0.006;P=0.005)。地西他濱誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株SGC-7901中mi R-200c和mi R-141表達(dá)顯著升高(P=0.013;P=0.027),并能夠緩解由TGF-β誘導(dǎo)產(chǎn)生的mi R-200c和mi R-141表達(dá)的降低(P=0.005;P=0.007)。結(jié)論1胃癌中TGF-β的表達(dá)水平和mi R-200c/141Cp G島的甲基化水平明顯升高。2 TGF-β誘導(dǎo)胃癌中mi R-200c和mi R-141表達(dá)降低。3胃癌中升高的mi R-200c/141Cp G島的甲基化水平誘導(dǎo)mi R-200c和mi R-141表達(dá)降低。4地西他濱能夠通過降低mi R-200c/141Cp G島的甲基化水平促進(jìn)mi R-200c和mi R-141的表達(dá),并能夠緩解TGF-β對(duì)mi R-200c和mi R-141的抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 黃俊;伍菲菲;賀利恒;張志偉;;miR-200c在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J];亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥;2014年08期

2 朱名毅;姚金光;劉津;;miR-200c在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的研究進(jìn)展[J];右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2014年01期

3 徐寧;趙霞;;miR-200c與卵巢癌的研究進(jìn)展[J];四川解剖學(xué)雜志;2014年01期

4 ;[J];;年期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 周欣亮;miR-200c和miR-141在胃癌中表達(dá)、功能及其調(diào)節(jié)機(jī)制的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 韓興寶;外周血miR-200c在膀胱癌中應(yīng)用價(jià)值初步研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：2546856