【摘要】：肝癌是目前臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率逐年增高,與之而來(lái)的是肝癌的死亡率也在不斷升高。2012年全球因肝癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)達(dá)到745000人,是惡性腫瘤致死的重要原因。我國(guó)的肝癌死亡率高居各種腫瘤的第二位。這主要是由于肝癌起病隱匿,發(fā)現(xiàn)時(shí)已至中晚期,且治療肝癌的主要方法仍為手術(shù)治療、局部消融、肝動(dòng)脈栓塞化療、放療、系統(tǒng)化療以及傳統(tǒng)中藥治療等,療效不盡如人意。因此迫切需要闡明肝癌的發(fā)病機(jī)制,挖掘有價(jià)值的早期診斷以及治療的生物靶標(biāo)。CDHR2屬于鈣粘蛋白超家族中原鈣粘蛋白超家族中的一員,由于其主要表達(dá)于人的肝、腎、以及結(jié)直腸等組織器官中,最初被命名為PCDH LKC(原鈣粘蛋白LKC)。CDHR2蛋白由1310個(gè)氨基酸組成,在結(jié)構(gòu)上包括7個(gè)鈣粘蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域,1個(gè)跨膜區(qū)和PDZ結(jié)合域。原鈣粘蛋白是一種帶有親同種抗原結(jié)合活性的跨膜蛋白,它們主要由幾個(gè)到110個(gè)胞外段鈣粘蛋白重復(fù)序列組成的。以往的研究表明原鈣粘蛋白的表達(dá)水平與細(xì)胞增殖緊密相關(guān)。由基因突變引起的原鈣粘蛋白表達(dá)水平的下調(diào)或者其功能的改變可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,表明原鈣粘蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CDHR2作為原鈣粘蛋白超家族中的一員,也具有相似的特性。研究發(fā)現(xiàn),在結(jié)直腸癌細(xì)胞中CDHR2通過(guò)改變?chǔ)?catenin的分布來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞接觸抑制的發(fā)生,從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖,表明CDHR2在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。而CDHR2在肝癌中表達(dá)及作用還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。我們?cè)谇捌谘芯恐?通過(guò)基因芯片技術(shù)篩選發(fā)現(xiàn),與癌旁組織相比,CDHR2在肝癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)。本課題中我們分析了CDHR2在肝癌中的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制,探討CDHR2在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及其作用的分子機(jī)制。首先通過(guò)半定量PCR的方法和Western-blot的方法檢測(cè)CDHR2在多種肝癌細(xì)胞中的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。構(gòu)建攜帶CDHR2的慢病毒表達(dá)系統(tǒng),感染CDHR2低表達(dá)或缺失的肝癌細(xì)胞,通過(guò)細(xì)胞倍增、EDU的摻入、平板克隆、以及平板軟瓊脂克隆形成等實(shí)驗(yàn),分析CDHR2的過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力和非錨著依賴性生長(zhǎng)能力的影響。通過(guò)裸鼠體內(nèi)移植瘤模型檢測(cè)CDHR2對(duì)肝癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響。通過(guò)高通量蛋白芯片檢測(cè)技術(shù)探討肝癌細(xì)胞中CDHR2的表達(dá)對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的改變情況,并進(jìn)行了初步的驗(yàn)證。通過(guò)甲基化水平的檢測(cè)分析肝癌細(xì)胞中CDHR2的低表達(dá)是否與表觀遺傳學(xué)調(diào)控有關(guān)。設(shè)計(jì)CDHR2特異性多肽制備了兔多克隆抗體用于Western blot和免疫組化實(shí)驗(yàn)。收集臨床肝癌組織標(biāo)本,進(jìn)行半定量PCR和免疫組化實(shí)驗(yàn),檢測(cè)肝癌組織標(biāo)本中CDHR2的表達(dá)情況。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDHR2在多種肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)或者缺失。在低表達(dá)CDHR2的肝癌細(xì)胞系smmc-7721和PLC/PRF/5中,過(guò)表達(dá)CDHR2可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖、克隆形成和非錨著依賴性生長(zhǎng)的能力;且具有抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的作用。在機(jī)制研究中我們發(fā)現(xiàn)CDHR2可抑制Akt的磷酸化,下調(diào)COX-2的表達(dá),從而發(fā)揮其抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用;通過(guò)轉(zhuǎn)染激活型Akt,可逆轉(zhuǎn)CDHR2下調(diào)COX-2的表達(dá)及其抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中CDHR2的低表達(dá)部分與其啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化有關(guān)。在臨床肝癌組織標(biāo)本檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)CDHR2的mRNA和蛋白水平在肝癌組織中均呈現(xiàn)一個(gè)普遍表達(dá)下調(diào)或缺失的狀態(tài)。我們的結(jié)果首次闡明了CDHR2在肝癌中呈表達(dá)下調(diào)或缺失,過(guò)表達(dá)CDHR2可通過(guò)Akt信號(hào)通路介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的增殖抑制,從而抑制了肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng),揭示了一種新的肝癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制。
【圖文】：

體重。根據(jù)公式 V=ab2/2 來(lái)計(jì)算腫瘤的變化。其中 a 為長(zhǎng)的直徑，b 為短的直徑。（五）統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析及檢驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用軟件 SPSS19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均采用 t 檢驗(yàn)對(duì)其均數(shù)進(jìn)行比較。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（一）CDHR2 在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì) 7 種肝癌細(xì)胞中的 CDHR2 的表達(dá)情況進(jìn)行半定量 RT-PCR 的檢測(cè)。結(jié)果顯示（圖 1-1），在所檢測(cè)的 7 種肝癌細(xì)胞系中，smmc-7721、HepG3B、PLC/PRF/5、Huh7、HCC-LM3 細(xì)胞中的 CDHR2 含量缺失或明顯減少，，而 HepG2 細(xì)胞呈高表達(dá)的狀態(tài)，提示 CDHR2 基因在肝癌細(xì)胞中呈普遍下調(diào)。

原鈣粘蛋白 CDHR2 在肝癌中的表達(dá)及其功能的隨后，我們提取 7 種肝癌細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行 Western blot 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與半定-PCR 檢測(cè)的結(jié)果基本一致，smmc-7721、PLC/PRF/5、Huh7、HCC-LM3HCC-97L 細(xì)胞中 CDHR2 的蛋白表達(dá)下調(diào)，而 Hep3B 表達(dá)缺失，HepG2 中呈高（圖 1-2）。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

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