【摘要】：目的:通過對乳腺癌及癌旁正常組織標本的實驗研究,探討micro RNA-338-3p與組織分級及腫瘤TNM分期的相關性,并在乳腺癌細胞及正常人乳腺上皮細胞中進行驗證。在此基礎上利用正常人乳腺上皮細胞、多種乳腺腫瘤細胞系及裸鼠分別進行實驗,并通過軟件進行靶標基因預測,探討micro RNA-338-3p發(fā)揮乳腺癌抑制作用的機制,從而為乳腺癌的治療提供新的策略和方向。方法:未接受放化療的乳腺癌術中癌組織及周圍正常組織(3cm)進行總RNA抽提,逆轉錄合成c DNA,通過實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transeription PCR,q RT-PCR)進行micro RNA-338-3p表達檢測,差異性表達結果與組織分級、腫瘤TNM分期、年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移情況等進行相關性分析。然后分別以正常人乳腺上皮細胞系MCF-10A,乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231、BT-549、MDA-MB-453作為研究對象,通過q RT-PCR手段明確各細胞系中micro RNA-338-3p表達情況,進一步驗證micro RNA-338-3p與乳腺癌的關系。隨后,通過瞬時轉染micro RNA-338-3p模擬物(mimics),并設立空白對照(mi R-NC),經(jīng)q RT-PCR及Western Blot驗證評估,明確轉染效率后,分別行MTT試驗、集落形成實驗、細胞周期和凋亡實驗、細胞劃痕實驗和侵襲實驗,探討micro RNA-338-3p調控乳腺癌的作用特點和機制。鑒于已獲得的micro RNA-338-3p與乳腺癌相關性的初步研究結果,利用開放的生物信息平臺Targetscan6.2及mi Randa進行micro RNA-338-3p在乳腺癌細胞調控網(wǎng)絡中的下游靶標基因的預測,結合基因已有的生物學特點,獲取目標基因sox4為研究對象,探討micro RNA-338-3p與靶標基因的調控關系。以乳腺癌細胞系MDA-MB-231為研究對象,構建雙熒光素霉報告載體WT-3'-UTR SOX4-p GL3、MT-3'-UTR-SOX4-p GL3質粒,對mi R-338-3p組和mi R-NC組分別進行轉染,通過q RT-PCR和western blot進行驗證并評價micro RNA-338-3p對目標基因sox4表達調控的特點。利用Si RNA目標SOX4(si-SOX4)和負對照(si-NC)對乳腺癌細胞MDA-MB-231分別進行轉染,并對SOX4表達、乳腺癌細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲、細胞凋亡和細胞周期進行評價,探討SOX4沉默對乳腺癌細胞的影響。利用mi R-NC、mi R-338-3p模擬物,空載體(p CDNA3.0Vector)以及過表達SOX4(p CDNA3-SOX4)質粒對乳腺癌細胞MDA-MB-231分別進行轉染,并對SOX4表達、乳腺癌細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲、細胞凋亡和細胞周期進行評價,探討過表達SOX4與mi R-388-3p的直接作用關系。采用micro RNA-338-3p模擬物及mi R-NC轉染預處理的乳腺癌細胞MDA-MB-231進行裸鼠的成瘤實驗。成瘤期間每周對瘤體變化情況進行記錄。5周后,處死小鼠,獲取組織標本,分別對mi R-338-3p組,正常組織及空白對照組mi R-NC在成瘤大小和速度,mi R-338-3p的m RNA水平,SOX4蛋白的表達情況等進行統(tǒng)計學分析,最終得出了micro RNA-338-3通過調控SOX4發(fā)揮乳腺癌的抑制作用的研究結論。結果:micro RNA-338-3p抑制乳腺癌組織和細胞系。前期留取未接受放化療的乳腺癌患者的癌組織及癌癥旁3cm組織,通過q RT-PCR進行micro RNA-338-3p的表達檢測。來自于臨床的32例樣本,以均值(0.45±0.04)為界,分為高表達組(n=17)和低表達組(n=15),比對與組織分級、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結轉移及年齡等相關性。在12例組織分級為進展期乳腺癌(stage III)患者中,9例出現(xiàn)了micro RNA-338-3p的低表達(75%);20例組織分級為早期乳腺癌(stages I and II)患者中,僅6例存在micro RNA-338-3p的低表達(30%)。在13例伴有淋巴轉移的乳腺癌患者中,10例表現(xiàn)為micro RNA-338-3p低表達(76.9%);19例無淋巴轉移的乳腺癌患者中,僅5例表現(xiàn)為micro RNA-338-3p低表達(26.3%)。但并未觀察到臨床樣本中micro RNA-338-3p的水平與年齡、腫瘤大小、病理分期等存在相關性。與正常人乳腺上皮細胞系MCF-10A對比,micro RNA-338-3p在乳腺癌細胞系(MCF-7*、MDA-MB-453*、MDA-MB-231**、BT-549**)中表達明顯下降(*P0.05;**P0.01),其中以乳腺癌細胞MDA-MB-231中micro RNA-338-3p表達量最低。因此,選取MDA-MB-231細胞為研究對象進行micro RNA-338-3p模擬物瞬時轉染,并設空白對照組(mi R-NC)。q RT-PCR及western blot分析顯示,與mi R-NC組相比,實驗組可明顯下調micro RNA-338-3p表達水平。MTT實驗顯示,與對照組mi R-NC相比,過表達的mi R-338-3p明顯抑制細胞的增殖,其中48h時P0.05,72h時P0.01。集落形成實驗顯示,實驗組細胞集落數(shù)較對照組數(shù)量減少,P0.01。劃痕實驗結果顯示,轉染micro RNA-338-3p模擬物后24h,可見mi R-NC組細胞遷移速度快于MDA-MB-231細胞實驗組,P0.01。細胞侵襲實驗顯示,轉染micro RNA-338-3p模擬物后,MDA-MB-231細胞的侵襲能力下降,穿過基底膜的細胞數(shù)量較空白對照組mi R-NC明顯減少,P0.01。與mi R-NC相比,轉染了micro RNA-338-3p模擬物的乳腺癌細胞處于G1期的比例增多(P0.01),S期比例下降(P0.05),并且可明顯誘導乳腺癌細胞凋亡。鑒于已獲得的micro RNA-338-3p與乳腺癌的相關性,利用開放的生物信息平臺Targetscan6.2及mi Randa進行micro RNA-338-3p在乳腺癌調控網(wǎng)絡中的下游靶基因預測,結合基因已有生物學特點推測sox4基因可能為micro RNA-338-3p在乳腺癌調控過程中的下游靶基因。分別構建雙熒光素霉報告載體WT-3'-UTR SOX4-p GL3以及Mut-3'-UTR-SOX4-p GL3質粒,分別與micro RNA-338-3p模擬物(mimics)或mi R-NC,對MDA-MB-231細胞進行共轉染。轉染后,應用流式細胞儀進行檢測,結果顯示,乳腺癌細胞在轉染mi R-338-3p模擬物后,WT-3'-UTR-SOX4報告載體的活性被抑制(P0.01),但對MT-3'-UTR-SOX4報告載體沒有抑制作用,提示mi R-338-3p對SOX4 m RNA的3’-UTR端具有直接調節(jié)作用。對轉染后各分組細胞進行q RT-PCR分析,評價SOX4 m RNA表達量情況,結果顯示,與空白對照組相比,實驗組SOX4 m RNA表達量明顯下降,P0.01,具有統(tǒng)計學意義。對轉染后各組細胞進行western blot分析,評價SOX4蛋白表達量情況,以GAPDH為內(nèi)參,結果顯示,實驗組SOX4 m RNA表達量明顯下降,P0.01,具有統(tǒng)計學意義。western blot對SOX4蛋白表達的分析也得出了相同的結論。對已獲得的有關SOX4及mi R-338-3p數(shù)據(jù)進行Spearman相關分析,r=-0.6431,P0.001,得出了二者負相關的結論。通過轉染si-SOX4和si-NC,對各組細胞進行q RT-PCR分析,評價mi R-338-3p m RNA表達量情況,結果顯示,實驗組si-SOX4中mi R-338-3pm RNA表達量明顯下降,P0.01,具有統(tǒng)計學意義。western blot分析,評價SOX4蛋白表達量情況,結果顯示,實驗組si-SOX4中SOX4表達量明顯下降。取轉染后各組24h、48h及72h為觀察點,進行MMT實驗,可見si-SOX4組細胞增殖下降,其中48h時P0.05,72h時P0.01,結果顯示具有統(tǒng)計學意義。集落形成實驗顯示,實驗組細胞集落數(shù)較對照組數(shù)量減少,P0.01,具有統(tǒng)計學意義。流式細胞儀結果顯示,與si-NC組相比,實驗組si-SOX4的乳腺癌細胞處于G1期的比例增多(P0.01),S期比例下降(P0.05)。與si-NC組相比,實驗組si-SOX4的乳腺癌細胞凋亡增多,P0.01,具有統(tǒng)計學意義。劃痕實驗結果顯示,轉染si-SOX4后24h,可見si-SOX4組細胞遷移速度較對照組速度減慢,P0.01,結果顯示具有統(tǒng)計學意義。細胞侵襲實驗顯示,轉染si-SOX4后,MDA-MB-231細胞的侵襲能力下降,穿過基底膜的細胞數(shù)量較si-NC組減少,P0.01,結果顯示具有統(tǒng)計學意義。設立mi R-338-3p+SOX4組、mi R-338-3p+Vector組及mi R-NC+Vector組,分別進行相應轉染,結果顯示mi R-338-3p+Vector組中SOX4 m RNA表達量明顯下降(P0.01),SOX4蛋白表達量明顯下降。MMT實驗可見mi R-338-3p+Vector組細胞增殖下降,其中72h時P0.05,結果顯示具有統(tǒng)計學意義。集落形成實驗顯示,mi R-338-3p+Vector組細胞集落數(shù)較mi R-338-3p+SOX4組數(shù)量減少(P0.01)。細胞周期和凋亡檢測提示,mi R-338-3p+Vector組的乳腺癌細胞處于G1期的比例增多(P0.05),乳腺癌細胞凋亡比例增多(P0.05)。劃痕實驗結果顯示,mi R-338-3p+Vector組細胞遷移速度較mi R-338-3p+SOX4組速度減慢(P0.05)。細胞侵襲實驗顯示,mi R-338-3p+Vector組MDA-MB-231細胞的侵襲能力下降,穿過基底膜的細胞數(shù)mi R-338-3p+SOX4組減少,P0.01,結果顯示具有統(tǒng)計學意義。利用mi R-338-3p模擬物和mi R-NC預處理的MDA-MB-231細胞對裸鼠進行成瘤實驗。5周后,處死小鼠,并獲取組織標本。對成瘤期間每周瘤體變化進行線性比較,與mi R-338-3p組相比,可觀察到mi R-NC組瘤體生長迅速,mi R-NC組瘤體較實驗組大,P0.01,具有統(tǒng)計學意義。對癌組織中的SOX4進行q RT-PCR和western blot分析,結果提示,mi R-338-3p組較mi R-NC組表達明顯降低,P0.01,具有統(tǒng)計學意義。結論:乳腺癌是最常見的實體惡性腫瘤之一,也是女性癌癥相關死亡的主要原因。盡管手術技術、診斷方法和新的化療方案的逐步改進顯著降低乳腺癌相關死亡率,然而仍有近一半的乳腺癌患者在接受化療和/或激素治療后,出現(xiàn)遠處轉移。因此,對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及轉移的分子機制研究迫在眉睫。在近幾年的研究中顯示,小分子核糖核酸(micro RNA,mi RNA)已成為乳腺癌治療中較有前途的治療靶點。本研究通過對乳腺癌組織及正常組織、乳腺癌細胞系及裸鼠等進行一系列體外體內(nèi)實驗,我們得到了mi RNA-338-3p作為小分子糖核酸的一種,與乳腺癌的惡性程度腫瘤TNM分期成負相關性,可在乳腺癌細胞增殖、侵襲轉移及凋亡上發(fā)揮調控作用的結論,并通過靶基因預測和進一步的實驗明確了其通過介導調節(jié)下游靶基因sox4而發(fā)揮乳腺癌抑制作用的結論,從而為乳腺癌的治療提供新的策略和方向。
【圖文】：

明顯下降（P<0.05：MCF-7、MDA-MB-453；P<0.01：MDA-MB-231、BT-549），，以 MDA-MB-231 中 microRNA-338-3p 表達量最低。（圖 2-1B）

miR-338-3p過表達抑制乳腺癌細胞的增殖和集落形成Figure3-1.OverexpressionofmiR-338-3pinhibitedtheproliferationandcolonyformationofbreastcancercells.
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：2545550