【摘要】：胃癌(gastric cancer, GC)為最常見的惡性腫瘤之一,為消化道腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤。全世界每年胃癌新發(fā)病例數(shù)約為100萬,約占整個惡性腫瘤新發(fā)病例總數(shù)的8%,位居第4位。每年約有70多萬人死于胃癌,死亡率位居第2位,無性別差異。我國每年胃癌新發(fā)病例占全世界新發(fā)病例數(shù)的42%,發(fā)病率、死亡率為全球平均水平2倍,為胃癌發(fā)病率和死亡率最高的國家之一。早期胃癌在我國篩查率低,僅為10%左右,患者就診時多為進(jìn)展期胃癌(advanced gastriccarcinoma,AGC)。日本早期胃癌患者中無癥狀者占47.6%,不確定的消化道癥狀者占31.2%,有消化性潰瘍樣癥狀者僅占17.9%。而我國早期胃癌患者中91.3%的是因?yàn)椴淮_定消化道癥狀而就診,無癥狀患者僅為2.72%。目前在我國,胃癌的臨床現(xiàn)狀具有“三低三高”的特點(diǎn),所謂“三低”即早期診斷率低(≤10%)、手術(shù)切除率低(≤70%)、5年生存率低(40%左右)；“三高”即發(fā)病率高,且有年輕化趨勢、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、死亡率高。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多步驟、進(jìn)行性發(fā)展的過程,原因目前尚不完全清楚,牽涉多方面作用機(jī)制。對于胃癌患者的預(yù)后,日本國立癌癥中心對胃癌術(shù)后資料進(jìn)行多因素分析后得出結(jié)論：影響胃癌患者預(yù)后的因素主要為腫瘤的浸潤深度,其次為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況,另外尚與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤組織類型、腫瘤大小等有關(guān)。胃癌發(fā)生浸潤及轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多階段、多個基因參與受多因素調(diào)控的連續(xù)的復(fù)雜的主動過程,因此,對于胃癌發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移的基因及分子標(biāo)記物的研究對胃癌的早期診斷、治療、預(yù)后評定具有重要的臨床意義。CYP2W1為細(xì)胞色素P450超家族新型成員之一,研究表明,該酶在胎兒結(jié)腸內(nèi)源性表達(dá),出生后由于甲基化而沉寂,僅僅在胎鼠結(jié)腸及多種人體腫瘤組織中表達(dá)。CYP2W1高表達(dá)于胃腸道腫瘤,尤其高表達(dá)于結(jié)腸癌和直腸癌。CYP2W1基因片段最早在肝癌細(xì)胞系HepG2的cDNA文庫中被發(fā)現(xiàn),人類CYP2W1基因位于染色體7p22.3上,基因全長包含1473個核苷酸,9個外顯子,編碼490個氨基酸。CYP2W1在外源性及內(nèi)源性物質(zhì)代謝及腫瘤發(fā)生發(fā)展中的具體作用尚不完全清楚,但已有研究表明CYP2W1表達(dá)具有腫瘤特異性,在結(jié)腸腫瘤和腎上腺腫瘤尤為明顯,與患者的預(yù)后相關(guān),為結(jié)腸癌獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo),引起了研究者們的廣泛關(guān)注。關(guān)于胃癌中CYP2W1的表達(dá)及其與胃癌發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等關(guān)系的研究,迄今尚未見國內(nèi)外報道。Ki-67是較為肯定的與細(xì)胞周期相關(guān)的核增殖標(biāo)志物,僅僅存在于增殖細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi),所編碼的基因位于第10號染色體上,其表達(dá)隨細(xì)胞周期的進(jìn)展而增加,細(xì)胞分裂周期中,GO期不表達(dá),G1后期開始表達(dá),S和G2逐漸升高,M期達(dá)到高峰,細(xì)胞分裂結(jié)束后迅速降解消失,為反應(yīng)細(xì)胞增殖活性的重要指標(biāo),廣泛用于腫瘤細(xì)胞的增殖評估。研究表明,Ki-67在肺癌、肝癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中均有過表達(dá),并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。Ki-67在腫瘤組織中表達(dá)程度,對于評價腫瘤細(xì)胞的增殖活性,研究腫瘤的生物學(xué)行為及預(yù)后具有重要意義。研究Ki-67在胃癌組織中的表達(dá),對評估胃癌細(xì)胞的增殖活性及判定預(yù)后具有重要意義。本研究首先采用免疫組織化學(xué)技術(shù)(S-P技術(shù))檢測胃癌組織及相對應(yīng)的正常胃粘膜組織中CYP2W1和Ki-67蛋白表達(dá)情況,分析比較CYP2W1和Ki-67蛋白的表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系；分析CYP2W1和Ki-67蛋白表達(dá)的相關(guān)性。采用半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測胃癌組織中CYP2W1和Ki-67 mRNA和蛋白的表達(dá)情況；分析CYP2W1和Ki-67與胃癌預(yù)后關(guān)系。在胃癌及正常胃粘膜細(xì)胞系中,應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR和Western blot方法檢測各組細(xì)胞系中CYP2W1的表達(dá)量,分析其相關(guān)性。選取CYP2W1表達(dá)量相對較高的胃癌細(xì)胞系為研究對象,進(jìn)行細(xì)胞的分選與純度鑒定。應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)方法,繪制生長曲線圖,并應(yīng)用平板克隆實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究CYP2W1表達(dá)對胃癌細(xì)胞體外增殖生長能力的影響。采用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn),研究CYP2W1表達(dá)對胃癌細(xì)胞體外運(yùn)動遷移侵及襲能力的影響�？傊�,本實(shí)驗(yàn)以CYP2W1為分子靶點(diǎn),探討其在胃癌細(xì)胞增殖及與預(yù)后中的作用,共分為兩個部分。第一部分：CYP2W1在胃癌組織中的表達(dá)及其預(yù)后分析方法1.采用免疫組織化學(xué)技術(shù),檢測326例胃腺癌組織及相應(yīng)326例正常胃粘膜組織中CYP2W1和Ki-67蛋白的表達(dá)情況,分析比較CYP2W1、Ki-67的表達(dá)及其與胃癌臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系；2.采用半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測隨機(jī)選取10例胃腺癌組織和相對應(yīng)的正常胃粘膜組織中CYP2W1和Ki-67 mRNA和蛋白的表達(dá)情況,進(jìn)一步驗(yàn)證免疫組織化學(xué)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；3.做出Kaplan-Meier生存曲線,分析CYP2W1和Ki-67蛋白的表達(dá)與胃癌患者生存時間的關(guān)系,采用Spearson Correlation分析CYP2W1和Ki-67的相關(guān)性；4.采用SPSS17.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行統(tǒng)計處理。免疫組化結(jié)果應(yīng)用X2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,采用Kaplan-Meier存活曲線分析CYP2W1和Ki-67蛋白表達(dá)與胃癌患者預(yù)后之間的關(guān)系,并用COX比例風(fēng)險模型分析CYP2W1是否為胃癌患者預(yù)后較差的獨(dú)立危險因素。采用Spearson Correlation分析CYP2W1和Ki-67表達(dá)的相關(guān)性。其他數(shù)據(jù)應(yīng)用單因素方差分析。P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.CYP2W1蛋白主要定位于胃癌組織的癌細(xì)胞胞漿,正常胃粘膜組織中基本不表達(dá)；胃癌組織中CYP2W1蛋白和mRNA明顯高于正常胃粘膜組織(P0.05)。2. CYP2W1的表達(dá)與胃癌患者的性別、年齡、分化程度無明顯相關(guān)性(P0.05)。但與胃癌患者的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P0.05)。3. CYP2W1高水平表達(dá)的胃癌患者的生存率顯著低于CYP2W1低水平表達(dá)的胃癌患者,CYP2W1的表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。COX比例風(fēng)險模型結(jié)果表明,CYP2W1為胃癌患者預(yù)后較差的獨(dú)立危險因素。4.相關(guān)性分析結(jié)果顯示,CYP2W1和Ki-67在胃癌組織中的表達(dá)具有顯著的相關(guān)性(P0.05)。第二部分：CYP2W1表達(dá)上調(diào)對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響方法1.選取4組胃癌細(xì)胞及正常胃粘膜細(xì)胞系,應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR和Western blot方法,檢測各組細(xì)胞系中CYP2W1 mRNA及蛋白的表達(dá)量。2.采用MTT實(shí)驗(yàn)方法,繪制CYP2W1陽性胃癌細(xì)胞的生長曲線,并且利用平板克隆形成實(shí)驗(yàn),觀察單個胃癌細(xì)胞的成瘤能力的改變。3.應(yīng)用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)及劃痕愈合實(shí)驗(yàn),研究CYP2W1表達(dá)對胃癌細(xì)胞體外遷移侵襲能力的影響。4.統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS 17.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行統(tǒng)計處理。以x±s表示數(shù)據(jù),兩組統(tǒng)計數(shù)據(jù)之間的統(tǒng)計分析應(yīng)用t檢驗(yàn),三組及以三組以上統(tǒng)計數(shù)據(jù)應(yīng)用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計分析,P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.實(shí)時熒光定量PCR和Western blot結(jié)果顯示：4組胃癌細(xì)胞系(BGC-823、 SGC-7901、MKN-28、MGC-803)中CYP2W1 mRNA和蛋白的表達(dá)量均明顯高于正常胃粘膜細(xì)胞(GES-1),4組胃癌細(xì)胞系中,BGC-823細(xì)胞系中CYP2W1 mRNA和蛋白的表達(dá)量又明顯高于SGC-7901、MKN-28和MGC-803細(xì)胞系,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.MTT生長曲線、平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CYP2W1陽性胃癌細(xì)胞生長能力明顯高于正常胃粘膜細(xì)胞(GES-1)；CYP2W1陽性胃癌細(xì)胞的克隆形成的數(shù)量明顯高于正常胃粘膜細(xì)胞(GES-1),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3. Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：24小時CYP2W1陽性胃癌細(xì)胞侵襲穿過Transwell小室基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯高于正常胃粘膜細(xì)胞(GES-1)侵襲穿過Transwell小室基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量,二者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：劃痕后24小時/48小時CYP2W1陽性胃癌細(xì)胞劃痕修復(fù)速率明顯高于正常胃粘膜細(xì)胞(GES-1), CYP2W1陽性胃癌細(xì)胞劃痕愈合面積明顯高于正常胃粘膜細(xì)胞(GES-1),二者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.CYP2W1僅在胃癌組織中表達(dá),在正常胃粘膜組織中不表達(dá)；CYP2W1的表達(dá)與胃癌患者的性別、年齡、分化程度無明顯相關(guān)性,但與胃癌患者的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。2. CYP2W1與Ki-67在胃癌中表達(dá)呈正相關(guān)；CYP2W1的表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān),CYP2W1為胃癌患者預(yù)后較差的獨(dú)立危險因素。3.CYP2W1與胃癌細(xì)胞的生長增殖能力及運(yùn)動遷移侵襲能力明顯相關(guān)。4. CYP2W1的高表達(dá)可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,可能成為一種新型的腫瘤治療的藥物靶點(diǎn),為胃癌的靶向治療提供新的思路。
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圖１－１胃癌巧織與正常胃粘腺組織中ＣＹＰ２Ｗ１表達(dá)（４０0ｘ）逡逑

１：胃癌組織邐２：正常胃組織逡逑圖１－１胃癌巧織與正常胃粘腺組織中ＣＹＰ２Ｗ１表達(dá)（４０0ｘ）逡逑；＇巧f跎跡航獺１常哄義希懾澹�？沪逦，，邋＊？逦／邋？逦、．［E�？？逦？邋？、艺d澹垮義匣Ъ攔�？？做嵖？？ＧG�？辶x希眨誨澹鄭澹�？／．？？／：辶x希保何赴┳櫓危玻赫Ｎ缸櫓義賢跡保參竿醋櫓胝Ｎ剛襯ぷ櫓校耍椋叮繁澩錚ǎ矗

本文編號：2544692