【摘要】：背景和目的:食管癌是人類最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,根據(jù)2012年國際癌癥研究機構(IARC)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,每年在全世界范圍內(nèi)新發(fā)的食管癌病例高達45.58萬,標化發(fā)病率約為5.90/10萬,在人類全部惡性腫瘤發(fā)病中位居第8位;每年因為食管癌死亡的患者病例高達40.02萬,標化死亡率約為5.00/10萬,在人類全部惡性腫瘤中位居第6位,嚴重威脅著人類的生命和健康[1-3]。食管癌發(fā)病呈明顯的地域分布特征,我國是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家之一,據(jù)我國癌癥中心的統(tǒng)計數(shù)據(jù)結果顯示:在2012年我國食管癌的發(fā)病率為21.17/10萬,在我國全部惡性腫瘤中位居第5位,死亡率為15.58/10萬,在全部惡性腫瘤中位居第4位[4,5]。與病理類型多為腺癌的歐美西方國家不同,我國食管癌病理類型90%以上為食管鱗狀細胞癌。目前食管癌的病因尚未完全明確,臨床上多采取手術治療為主,放、化療及其他治療方法為輔的綜合治療方案。但是由于食管癌發(fā)病早期的癥狀不明顯以及缺乏簡單、可靠的早期診斷技術,高達70%的食管癌患者就診時病程己經(jīng)處于中、晚期;即使已行手術治療的患者,由于缺乏術后特異性、敏感性高的監(jiān)測指標,惡性腫瘤局部復發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移等的發(fā)生嚴重影響了患者的生活質(zhì)量和預后;另外目前國內(nèi)外研究尚未發(fā)現(xiàn)針對食管癌敏感的治療靶點及相對應的靶向治療藥物[6-8]。綜合以上各種原因,食管癌總體治療效果遠未達到令人滿意,食管癌5年平均生存率僅為30-40%。因此立足本國食管癌的發(fā)病特點,加強食管癌的理論研究,尋找敏感性、特異性高的檢測指標、治療靶點及相對應的靶向藥物,意義重大。有絲分裂誘導基因6(Mitogen induced gene 6,Mig-6)是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因,在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、肝細胞癌,非小細胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、皮膚癌、腦膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌等多種人類常見惡性腫瘤中均觀察到了Mig-6基因的表達缺失和蛋白質(zhì)的表達下降;Mig-6基因敲除的小鼠容易罹患如肺、膽囊、膽管、子宮、胃腸道等多個器官、組織的惡性腫瘤[9-12]。體外實驗發(fā)現(xiàn)Mig-6可抑制腫瘤細胞的生長增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,引發(fā)腫瘤細胞的凋亡。而有關Mig-6與食管鱗狀細胞癌的關系國內(nèi)外文獻未見報道,Mig-6在食管鱗狀細胞癌中是否起到抑癌作用、若存在抑癌作用其作用機制值得進一步研究。本實驗研究在人食管鱗狀細胞癌組織及癌旁正常食管組織中應用應用實時熒光定量PCR(Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)及免疫組織化學染色的實驗方法分別檢測Mig-6基因及蛋白的表達,統(tǒng)計學分析其表達與患者臨床病理參數(shù)的相關性;Real-time PCR的實驗方法在人食管鱗狀細胞癌細胞株TE13、EC109、KYSE510中篩選出Mig-6基因m RNA相對低表達的細胞株,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)Mig-6基因的表達,觀察人食管鱗癌細胞株生長增殖和凋亡水平的改變;應用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染聯(lián)合基因芯片的技術檢測Mig-6基因表達上調(diào)后食管鱗癌細胞基因表達譜的改變情況,篩選與Mig-6相互作用的上、下游基因及可能參與的信號通路,初步探討Mig-6基因在食管鱗癌中發(fā)揮抑癌作用的可能機制。方法:1、應用Real-time PCR的實驗方法檢測人的食管鱗狀細胞癌組織以及相應的癌旁正常食管組織(距離腫瘤邊緣≥5cm)中Mig-6基因m RNA的表達;免疫組化的實驗方法檢測食管鱗狀細胞癌組織及癌旁正常食管組織中Mig-6蛋白的表達,若存在食管鱗狀細胞癌組織中Mig-6的表達下降,統(tǒng)計學分析其與性別、年齡、腫瘤部位、TNM分期及腫瘤分化程度等臨床病理參數(shù)之間的關系。2、常規(guī)培養(yǎng)人食管鱗狀細胞癌細胞株TE13、EC109、KYSE510,采用Real-time PCR的實驗方法對Mig-6基因在3株食管鱗癌細胞中的m RNA的表達水平進行檢測,篩選出Mig-6基因m RNA相對低表達的人食管鱗癌細胞株TE13。3、常規(guī)培養(yǎng)人食管鱗癌細胞株TE13,傳代后細胞分為2組:實驗組轉(zhuǎn)染含Mig-6的真核表達質(zhì)粒pc DNA3.1(+)/Mig-6,對照組轉(zhuǎn)染空白真核表達質(zhì)粒pc DNA3.1(+)。采用Real-time PCR和Western Blotting的實驗方法驗證轉(zhuǎn)染效率,確認轉(zhuǎn)染成功。分別在轉(zhuǎn)染后24、48和72小時應用MTT實驗來檢測兩組細胞的生長增殖情況,繪制細胞的生長曲線,計算細胞的生長抑制率;轉(zhuǎn)染48小時后進行流式細胞學檢測,觀察食管鱗癌細胞凋亡水平的改變。4、常規(guī)培養(yǎng)人食管鱗癌細胞株TE13,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)Mig-6基因的表達,轉(zhuǎn)染成功以后,應用Agilent人類全基因表達譜基因芯片篩選差異基因(差異倍數(shù)foldchange≥2或≤0.5),然后對篩選出的差異基因進行綜合分析,初步探討Mig-6基因可能的抑癌作用機制。結果:1、食管鱗狀細胞癌組織和癌旁正常食管組織相比Mig-6基因m RNA表達水平相對較低(1.00VS1.67±0.16),差異有統(tǒng)計學意義(t=22.627,P=0.000);免疫組化結果顯示,在食管鱗狀細胞癌組織中Mig-6蛋白的表達陽性率顯著低于癌旁正常食管組織,差異有統(tǒng)計學意義(x~2=21.679,P=0.000)。統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)Mig-6的表達和患者性別(x~2=0.859,P=0.354),年齡(x~2=0.892,P=0.741)、腫瘤部位(x~2=0.647,P=0.732)無關;和腫瘤TNM分期(x~2=4.21,P=0.04)和分化程度(x~2=8.438,P=0.004)相關。2、Real-time PCR的實驗方法檢測3種食管鱗癌細胞株TE13、EC109、KYSE510中Mig-6基因m RNA的表達水平,TE13與其余2株食管鱗癌細胞相比Mig-6基因m RNA表達水平相對較低(1.00VS6.77±1.17VS133.59±5.44),差異有統(tǒng)計學意義(F=3262.019,P=0.000),選取TE13作為下步轉(zhuǎn)染實驗的理想細胞株。3、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)食管鱗癌細胞株TE13中Mig-6基因的表達,Real-time PCR和Western Blotting的實驗方法確認轉(zhuǎn)染成功,MTT檢測結果顯示細胞的生長增殖受到抑制,隨著時間延長,細胞生長抑制變得明顯(F=11.051,P=0.001,);流式細胞學檢測的結果顯示細胞的凋亡率升高(22.44±3.69VS35.84±5.98),差異有統(tǒng)計學意義(t=4.669,P=0.001)。4、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)Mig-6基因的表達后,人食管鱗癌細胞株TE13基因表達譜發(fā)生廣泛改變:確定表達差異基因2212個,其中表達上調(diào)的基因1141個,表達下調(diào)的基因1071個,主要涉及信號通路有MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、細胞因子與受體間相互作用通路(Cytokine-cytokine receptor interaction)、細胞粘附分子(Cell adhesion molecules,CAMs)通路等。結論:1、在食管鱗狀細胞癌組織中存在Mig-6基因m RNA及蛋白表達水平下降,與食管鱗狀細胞癌TNM分期及腫瘤分化程度相關,Mig-6有可能成為食管鱗狀細胞癌的不良預后因子。2、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)食管鱗癌細胞株TE13中Mig-6基因的表達,應用Real-time PCR以及Western Blotting的實驗方法確認轉(zhuǎn)染成功后,食管癌細胞的生長增殖受到抑制,細胞的凋亡增加。3、轉(zhuǎn)染Mig-6基因后引起食管鱗狀細胞癌細胞株TEl3基因表達譜的廣泛變化,Mig-6基因可能通過與其相互作用的上、下游基因以及相關的如MAPK信號通路、細胞因子與受體間相互作用通路、細胞粘附分子通路等發(fā)揮抑制食管鱗狀細胞癌的作用,為后續(xù)的機制研究提供了方向。
【圖文】：
博士學位論文 一、Mig-6 在食管鱗癌中的表達及其與臨床病e PCR 反應，目的 Mig-6 基因及內(nèi)參 GAPDH 基因的擴 1.1-1.4 所示：目的基因和內(nèi)參的擴增曲線斜率一致性良無脫尾，說明提取的 RNA 無基因組 DNA 污染，引物設聚體，Real-time PCR 反應結果可反應目的基因的表達。
博士學位論文 一、Mig-6 在食管鱗癌中的表達及其與臨床病e PCR 反應，目的 Mig-6 基因及內(nèi)參 GAPDH 基因的擴 1.1-1.4 所示：目的基因和內(nèi)參的擴增曲線斜率一致性良無脫尾，說明提取的 RNA 無基因組 DNA 污染，引物設聚體，Real-time PCR 反應結果可反應目的基因的表達。圖 1.1：Real-time PCR 反應目的 Mig-6 基因擴增曲線
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.1
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本文編號：
2544652
