【摘要】：背景和目的:食管癌是人類(lèi)最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,根據(jù)2012年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,每年在全世界范圍內(nèi)新發(fā)的食管癌病例高達(dá)45.58萬(wàn),標(biāo)化發(fā)病率約為5.90/10萬(wàn),在人類(lèi)全部惡性腫瘤發(fā)病中位居第8位;每年因?yàn)槭彻馨┧劳龅幕颊卟±哌_(dá)40.02萬(wàn),標(biāo)化死亡率約為5.00/10萬(wàn),在人類(lèi)全部惡性腫瘤中位居第6位,嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命和健康[1-3]。食管癌發(fā)病呈明顯的地域分布特征,我國(guó)是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國(guó)家之一,據(jù)我國(guó)癌癥中心的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示:在2012年我國(guó)食管癌的發(fā)病率為21.17/10萬(wàn),在我國(guó)全部惡性腫瘤中位居第5位,死亡率為15.58/10萬(wàn),在全部惡性腫瘤中位居第4位[4,5]。與病理類(lèi)型多為腺癌的歐美西方國(guó)家不同,我國(guó)食管癌病理類(lèi)型90%以上為食管鱗狀細(xì)胞癌。目前食管癌的病因尚未完全明確,臨床上多采取手術(shù)治療為主,放、化療及其他治療方法為輔的綜合治療方案。但是由于食管癌發(fā)病早期的癥狀不明顯以及缺乏簡(jiǎn)單、可靠的早期診斷技術(shù),高達(dá)70%的食管癌患者就診時(shí)病程己經(jīng)處于中、晚期;即使已行手術(shù)治療的患者,由于缺乏術(shù)后特異性、敏感性高的監(jiān)測(cè)指標(biāo),惡性腫瘤局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等的發(fā)生嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和預(yù)后;另外目前國(guó)內(nèi)外研究尚未發(fā)現(xiàn)針對(duì)食管癌敏感的治療靶點(diǎn)及相對(duì)應(yīng)的靶向治療藥物[6-8]。綜合以上各種原因,食管癌總體治療效果遠(yuǎn)未達(dá)到令人滿意,食管癌5年平均生存率僅為30-40%。因此立足本國(guó)食管癌的發(fā)病特點(diǎn),加強(qiáng)食管癌的理論研究,尋找敏感性、特異性高的檢測(cè)指標(biāo)、治療靶點(diǎn)及相對(duì)應(yīng)的靶向藥物,意義重大。有絲分裂誘導(dǎo)基因6(Mitogen induced gene 6,Mig-6)是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因,在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、肝細(xì)胞癌,非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、皮膚癌、腦膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌等多種人類(lèi)常見(jiàn)惡性腫瘤中均觀察到了Mig-6基因的表達(dá)缺失和蛋白質(zhì)的表達(dá)下降;Mig-6基因敲除的小鼠容易罹患如肺、膽囊、膽管、子宮、胃腸道等多個(gè)器官、組織的惡性腫瘤[9-12]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Mig-6可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,引發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡。而有關(guān)Mig-6與食管鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)系國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道,Mig-6在食管鱗狀細(xì)胞癌中是否起到抑癌作用、若存在抑癌作用其作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)研究在人食管鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常食管組織中應(yīng)用應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)及免疫組織化學(xué)染色的實(shí)驗(yàn)方法分別檢測(cè)Mig-6基因及蛋白的表達(dá),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性;Real-time PCR的實(shí)驗(yàn)方法在人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE13、EC109、KYSE510中篩選出Mig-6基因m RNA相對(duì)低表達(dá)的細(xì)胞株,通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)Mig-6基因的表達(dá),觀察人食管鱗癌細(xì)胞株生長(zhǎng)增殖和凋亡水平的改變;應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染聯(lián)合基因芯片的技術(shù)檢測(cè)Mig-6基因表達(dá)上調(diào)后食管鱗癌細(xì)胞基因表達(dá)譜的改變情況,篩選與Mig-6相互作用的上、下游基因及可能參與的信號(hào)通路,初步探討Mig-6基因在食管鱗癌中發(fā)揮抑癌作用的可能機(jī)制。方法:1、應(yīng)用Real-time PCR的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)人的食管鱗狀細(xì)胞癌組織以及相應(yīng)的癌旁正常食管組織(距離腫瘤邊緣≥5cm)中Mig-6基因m RNA的表達(dá);免疫組化的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常食管組織中Mig-6蛋白的表達(dá),若存在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Mig-6的表達(dá)下降,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其與性別、年齡、腫瘤部位、TNM分期及腫瘤分化程度等臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。2、常規(guī)培養(yǎng)人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE13、EC109、KYSE510,采用Real-time PCR的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)Mig-6基因在3株食管鱗癌細(xì)胞中的m RNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),篩選出Mig-6基因m RNA相對(duì)低表達(dá)的人食管鱗癌細(xì)胞株TE13。3、常規(guī)培養(yǎng)人食管鱗癌細(xì)胞株TE13,傳代后細(xì)胞分為2組:實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染含Mig-6的真核表達(dá)質(zhì)粒pc DNA3.1(+)/Mig-6,對(duì)照組轉(zhuǎn)染空白真核表達(dá)質(zhì)粒pc DNA3.1(+)。采用Real-time PCR和Western Blotting的實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率,確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功。分別在轉(zhuǎn)染后24、48和72小時(shí)應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況,繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率;轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè),觀察食管鱗癌細(xì)胞凋亡水平的改變。4、常規(guī)培養(yǎng)人食管鱗癌細(xì)胞株TE13,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)Mig-6基因的表達(dá),轉(zhuǎn)染成功以后,應(yīng)用Agilent人類(lèi)全基因表達(dá)譜基因芯片篩選差異基因(差異倍數(shù)foldchange≥2或≤0.5),然后對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行綜合分析,初步探討Mig-6基因可能的抑癌作用機(jī)制。結(jié)果:1、食管鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁正常食管組織相比Mig-6基因m RNA表達(dá)水平相對(duì)較低(1.00VS1.67±0.16),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.627,P=0.000);免疫組化結(jié)果顯示,在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Mig-6蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率顯著低于癌旁正常食管組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x~2=21.679,P=0.000)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Mig-6的表達(dá)和患者性別(x~2=0.859,P=0.354),年齡(x~2=0.892,P=0.741)、腫瘤部位(x~2=0.647,P=0.732)無(wú)關(guān);和腫瘤TNM分期(x~2=4.21,P=0.04)和分化程度(x~2=8.438,P=0.004)相關(guān)。2、Real-time PCR的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)3種食管鱗癌細(xì)胞株TE13、EC109、KYSE510中Mig-6基因m RNA的表達(dá)水平,TE13與其余2株食管鱗癌細(xì)胞相比Mig-6基因m RNA表達(dá)水平相對(duì)較低(1.00VS6.77±1.17VS133.59±5.44),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3262.019,P=0.000),選取TE13作為下步轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的理想細(xì)胞株。3、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)食管鱗癌細(xì)胞株TE13中Mig-6基因的表達(dá),Real-time PCR和Western Blotting的實(shí)驗(yàn)方法確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功,MTT檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖受到抑制,隨著時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)抑制變得明顯(F=11.051,P=0.001,);流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的結(jié)果顯示細(xì)胞的凋亡率升高(22.44±3.69VS35.84±5.98),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.669,P=0.001)。4、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)Mig-6基因的表達(dá)后,人食管鱗癌細(xì)胞株TE13基因表達(dá)譜發(fā)生廣泛改變:確定表達(dá)差異基因2212個(gè),其中表達(dá)上調(diào)的基因1141個(gè),表達(dá)下調(diào)的基因1071個(gè),主要涉及信號(hào)通路有MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、細(xì)胞因子與受體間相互作用通路(Cytokine-cytokine receptor interaction)、細(xì)胞粘附分子(Cell adhesion molecules,CAMs)通路等。結(jié)論:1、在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中存在Mig-6基因m RNA及蛋白表達(dá)水平下降,與食管鱗狀細(xì)胞癌TNM分期及腫瘤分化程度相關(guān),Mig-6有可能成為食管鱗狀細(xì)胞癌的不良預(yù)后因子。2、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)食管鱗癌細(xì)胞株TE13中Mig-6基因的表達(dá),應(yīng)用Real-time PCR以及Western Blotting的實(shí)驗(yàn)方法確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后,食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖受到抑制,細(xì)胞的凋亡增加。3、轉(zhuǎn)染Mig-6基因后引起食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TEl3基因表達(dá)譜的廣泛變化,Mig-6基因可能通過(guò)與其相互作用的上、下游基因以及相關(guān)的如MAPK信號(hào)通路、細(xì)胞因子與受體間相互作用通路、細(xì)胞粘附分子通路等發(fā)揮抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的作用,為后續(xù)的機(jī)制研究提供了方向。
【圖文】：

博士學(xué)位論文 一、Mig-6 在食管鱗癌中的表達(dá)及其與臨床病e PCR 反應(yīng)，目的 Mig-6 基因及內(nèi)參 GAPDH 基因的擴(kuò) 1.1-1.4 所示：目的基因和內(nèi)參的擴(kuò)增曲線斜率一致性良無(wú)脫尾，說(shuō)明提取的 RNA 無(wú)基因組 DNA 污染，引物設(shè)聚體，Real-time PCR 反應(yīng)結(jié)果可反應(yīng)目的基因的表達(dá)。

博士學(xué)位論文 一、Mig-6 在食管鱗癌中的表達(dá)及其與臨床病e PCR 反應(yīng)，目的 Mig-6 基因及內(nèi)參 GAPDH 基因的擴(kuò) 1.1-1.4 所示：目的基因和內(nèi)參的擴(kuò)增曲線斜率一致性良無(wú)脫尾，說(shuō)明提取的 RNA 無(wú)基因組 DNA 污染，引物設(shè)聚體，Real-time PCR 反應(yīng)結(jié)果可反應(yīng)目的基因的表達(dá)。圖 1.1：Real-time PCR 反應(yīng)目的 Mig-6 基因擴(kuò)增曲線
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R735.1

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本文編號(hào)：2544652