【摘要】：背景:眾所周知,腫瘤細(xì)胞的長期生存依賴于周邊的低氧酸性微環(huán)境,腫瘤酸性微環(huán)境對腫瘤的增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移均發(fā)揮了重要作用。而正常細(xì)胞卻無法耐受這種胞外酸性胞內(nèi)中性至堿性的特殊環(huán)境,推測腫瘤細(xì)胞之所以能在酸性環(huán)境下生存,一定有其自身的適應(yīng)機(jī)制。自噬在清除有害物質(zhì)、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用。酸性微環(huán)境能否誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬活化,以及自噬功能和具體作用機(jī)制,目前尚不清楚。目的:研究腫瘤賴以生存的酸性微環(huán)境對肺癌細(xì)胞自噬的影響及自噬所發(fā)揮的作用,探討酸誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制,從而為理解酸性微環(huán)境對肺癌細(xì)胞生存、增殖的影響,為腫瘤在酸性微環(huán)境下生存提供了理論支持,另外,通過對自噬活化的信號通路的研究有助于我們找到有效的抗腫瘤治療方法。方法:(1)明確酸性刺激誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬將A549和NCI-H226細(xì)胞株暴露于不同酸度的培養(yǎng)基,設(shè)定不同的培養(yǎng)時間,用western blot檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況,進(jìn)一步通過電鏡、熒光顯微鏡觀察酸性條件下肺癌細(xì)胞內(nèi)自噬小體的變化情況;通過用western blot法檢測p62蛋白及細(xì)胞在自噬抑制劑Bafilomycin A1(Baf)作用下LC3 II的表達(dá)情況判斷自噬流的存在。(2)明確酸性刺激誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬的功能分別運(yùn)用自噬抑制劑3-ma、baf及rna干擾方法抑制自噬后,用流式細(xì)胞儀檢測酸性環(huán)境下肺癌細(xì)胞凋亡水平的變化情況,westernblot法評估凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。通過利用a549細(xì)胞建立裸鼠肺癌皮下瘤模型,用碳酸氫鈉干預(yù)腫瘤酸性微環(huán)境后,通過測量腫瘤的體積、重量,westernblot檢測自噬相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),判斷抑制自噬對肺癌細(xì)胞凋亡的影響。(3)明確酸性刺激誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬的作用機(jī)制不同酸濃度的培養(yǎng)基處理肺癌細(xì)胞后,westernblot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)重要信號分子及p-ampk、p-akt、p-mtor各分子的表達(dá)情況;用流式細(xì)胞儀檢測不同酸刺激后肺癌細(xì)胞內(nèi)活性氧(ros)的變化情況;通過用ros抑制劑干預(yù)細(xì)胞后,westernblot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號分子的表達(dá)情況;通過用grp78sirna抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后,westernblot檢測酸性條件下肺癌細(xì)胞表達(dá)自噬相關(guān)蛋白及p-ampk、p-mtor的變化情況。用compoundc抑制ampk后,westernblot檢測lc3ii的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)酸性微環(huán)境誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生自噬,并在一定范圍內(nèi)呈濃度-時間依賴性使用培養(yǎng)基(ph:6.6、6.9、7.4)分別培養(yǎng)a549和nci-h226細(xì)胞后,lc3ii和beclin1蛋白表達(dá)明顯上調(diào),且以ph6.6培養(yǎng)基中細(xì)胞內(nèi)lc3ii、beclin1蛋白表達(dá)量最高,相反,p62蛋白表達(dá)呈下降趨勢。透射電鏡觀察酸刺激下細(xì)胞內(nèi)可見典型雙層膜的泡狀結(jié)構(gòu),即自噬小體形成。通過轉(zhuǎn)染gfp-lc3質(zhì)粒,在熒光顯微鏡下觀察到肺癌細(xì)胞內(nèi)點狀熒光較對照組明顯增多;暴露細(xì)胞于ph6.6培養(yǎng)基中分別作用12、24、48、72h后,lc3ii、beclin1蛋白表達(dá)呈時間依賴性。利用baf抑制自噬后,再給予細(xì)胞酸刺激,免疫熒光法發(fā)現(xiàn)點狀熒光聚集較對照組明顯增多,lc3ii蛋白表達(dá)也支持上述實驗結(jié)果。(2)酸誘導(dǎo)體內(nèi)外肺癌細(xì)胞自噬具有保護(hù)作用分別用3-ma、baf抑制自噬后,再給予a549細(xì)胞酸處理,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn),酸聯(lián)合3-ma處理組細(xì)胞凋亡率為(35±3.25)%,酸聯(lián)合baf處理組細(xì)胞凋亡率為(37±4.26)%。下調(diào)自噬相關(guān)基因beclin1抑制自噬后,首先用cck-8法證實細(xì)胞活性較對照組明顯降低,進(jìn)一步用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率在酸聯(lián)合beclin1sirna組明顯升高,cleavedcaspase3和cleavedparp表達(dá)也相應(yīng)增強(qiáng)。裸鼠皮下瘤模型表明碳酸氫鈉組較對照組,腫瘤體積縮小,腫塊重量減輕,p62及cleavedcaspase3蛋白表達(dá)增強(qiáng),細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多,提示酸誘導(dǎo)自噬使肺癌細(xì)胞免受凋亡。(3)明確酸性刺激下,自噬活化的分子機(jī)制不同酸性培養(yǎng)基作用于肺癌細(xì)胞后,p-perk、p-eif2a、grp78、xbp-1s、atf6和p-ampk蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng),p-mtor表達(dá)減弱,p-akt表達(dá)無明顯變化,ros水平較對照組明顯升高,通過用抗氧化劑nac干預(yù)后,grp78、p-eif2a及l(fā)c3ii表達(dá)均減少,提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的變化情況與ros呈正相關(guān),進(jìn)一步用grp78sirna抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后,p-AMPK表達(dá)減弱,p-mTOR表達(dá)增強(qiáng),LC3 II含量降低,細(xì)胞免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn)點狀綠色熒光顆粒明顯減少。通過Compound C抑制AMPK以阻斷信號通路AMPK-mTOR后,LC3 II表達(dá)明顯減少。結(jié)論:(1)酸性刺激可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬活化。(2)肺癌細(xì)胞自噬活化可以使其免受凋亡。(3)酸性條件下肺癌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過多的ROS導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,并順序激活A(yù)MPK-mTOR通路,誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生,提示ROS-ERS信號通路參與自噬的活化。
【圖文】：

酸性培養(yǎng)基聯(lián) 不聯(lián) Baf 處理肺癌細(xì)胞 24h 后，，利用細(xì)胞免疫熒光技 檢測肺癌細(xì)胞內(nèi) 噬小體 變化情況。本實驗設(shè) control 組、Baf 組、酸處理組 酸+Baf 組。#p<0.05 與單純酸處理組比較。By pretreatment with Baf associated, lung cancer cells were cultured for 24h in acidic or normmedium, autophagysomes were detected by immunocytochemistry.圖 1-3-1. Baf 干預(yù)后，熒光顯微 下觀察胞內(nèi) 噬小體情況

-1.細(xì)胞檢測肺癌細(xì)胞凋亡情況
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：2544612