【摘要】：【目的】1、采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1(extracellular matrix protein 1,ECM1)在正常肝組織和肝癌組織中的表達(dá)情況,分析ECM1表達(dá)水平與肝癌臨床病理特征及生存預(yù)后間的關(guān)系,及其與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)有關(guān)標(biāo)志物(Vimentin和E-cadherin)的相關(guān)性,初步探討ECM1在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮的作用。2、將ECM1基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞株Bel-7402中,為深入探討ECM1在肝癌發(fā)生進展中的作用提供實驗基礎(chǔ)。3、研究穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ECM1基因后對肝癌細(xì)胞株Bel-7402侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響,并探討其與EMT間的關(guān)系。4、探索ECM1促進肝癌Bel-7402細(xì)胞EMT可能的分子機制。【方法】1、77例肝細(xì)胞癌蠟塊存檔標(biāo)本隨機選擇自安徽省立醫(yī)院普外科2008至2012年間的手術(shù)切除標(biāo)本,作3μm厚連續(xù)石蠟切片,分別做ECM1、Vimentin和E-cadherin免疫組化染色,分析其表達(dá)水平與肝癌臨床病理指標(biāo)及預(yù)后間的關(guān)系。2、根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)庫提供的ECM1基因序列,首先構(gòu)建其真核表達(dá)載體p EGFP-N2-ECM1,經(jīng)基因測序鑒定后,在脂質(zhì)體介導(dǎo)下穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株Bel-7402。3、采用RT-PCR、Western blot、劃痕試驗及Transwell等方法,利用構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)ECM1基因的肝癌細(xì)胞株Bel-7402,分別觀察靶細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變及EMT相關(guān)標(biāo)志物(Vimentin和E-cadherin)m RNA和蛋白表達(dá)水平的變化,以及轉(zhuǎn)染前后靶細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的改變,探討ECM1轉(zhuǎn)染能否通過調(diào)控肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT,從而促進肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移。4、為明確TGF-β-Smad通路在肝癌細(xì)胞Bel-7402發(fā)生EMT中的作用,用SB431542阻斷TGF-β-Smad通路,檢測阻斷前后肝癌細(xì)胞間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin和上皮性標(biāo)志物E-cadherin蛋白水平的變化及腫瘤細(xì)胞侵襲遷移能力的變化。【結(jié)果】1、77例肝癌組織標(biāo)本中,共有57例不同程度的表達(dá)ECM1,且在肝癌標(biāo)本中的陽性表達(dá)率(57/77)較正常肝臟組織(4/17)明顯升高。在肝癌組織標(biāo)本中,Vimentin的表達(dá)陽性率為61.0%,E-cadherin表達(dá)陽性率46.8%,表達(dá)缺失率為53.2%。統(tǒng)計學(xué)分析表明,ECM1的陽性表達(dá)率與肝癌的TNM分級和血管侵犯相關(guān),間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin的陽性表達(dá)率及E-cadherin的表達(dá)缺失率與肝癌的臨床分期顯著相關(guān),并且在肝癌組織中ECM1的表達(dá)陽性率與Vimentin呈正相關(guān),與E-cadherin無明顯相關(guān)性。2、成功構(gòu)建了ECM1的真核表達(dá)載體p EGFP-N2-ECM1,通過基因測序鑒定后,在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下將其轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞株Bel-7402中,用G418篩選后擴大培養(yǎng)所獲得的陽性克隆細(xì)胞。通過熒光顯微鏡、細(xì)胞免疫化學(xué)染色、RT-PCR和Western blot分別鑒定篩選陽性細(xì)胞,獲得穩(wěn)定高表達(dá)ECM1的ECM1/Bel-7402細(xì)胞模型。3、通過形態(tài)學(xué)觀察表明ECM1轉(zhuǎn)染Bel-7402細(xì)胞株后發(fā)生了與EMT相一致的形態(tài)學(xué)改變,細(xì)胞由成團生長、類圓形的形態(tài)向離散式生長、梭形形態(tài)的轉(zhuǎn)變;與未轉(zhuǎn)染組相比較,轉(zhuǎn)染組Vimentin的m RNA和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào),而E-cadherin的m RNA和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。細(xì)胞體外遷移能力試驗(劃痕試驗)和侵襲試驗(Transwell小室法)結(jié)果表明,增強轉(zhuǎn)染ECM1基因在Bel-7402細(xì)胞中的表達(dá)后,腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力較未轉(zhuǎn)染組明顯增強。4、用SB431542處理后的ECM1/Bel-7402細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞上皮樣形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變;其p-Smad表達(dá)水平較對照組明顯降低,說明SB431542阻斷了ECM1對TGF-β-Smad通路的活化,且Vimentin的蛋白表達(dá)水平明顯下降,E-cadherin的蛋白表達(dá)水平明顯上升,這些結(jié)果提示TGF-β1是ECM1誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞發(fā)生EMT過程中關(guān)鍵的信號通路。為了進一步評估SB431542阻滯劑對腫瘤細(xì)胞侵襲力的影響,采用Transwell試驗發(fā)現(xiàn),經(jīng)SB431542處理后,ECM1/Bel-7402組遷移的細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少,提示SB431542阻斷TGF-β-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后抑制了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力,進一步說明通過阻斷TGF-β-Smad轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻斷了ECM1的信號通路,使腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT表型的逆轉(zhuǎn),阻礙了腫瘤的遷移和侵襲過程�！窘Y(jié)論】1、免疫組化染色結(jié)果表明在肝癌組織中ECM1的表達(dá)陽性率較正常肝組織明顯升高,且與肝癌TNM分級和血管浸潤相關(guān),可作為肝癌患者術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)獨立的預(yù)測指標(biāo);肝癌組織中間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin的陽性表達(dá)率與ECM1的表達(dá)水平呈正相關(guān)。2、肝癌細(xì)胞株Bel-7402在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)ECM1基因后,腫瘤細(xì)胞在外觀形態(tài)和相關(guān)分子表達(dá)水平上發(fā)生了與EMT一致的表型及功能變化,并且細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力都明顯增強。3、ECM1可能通過TGF-β-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞Bel-7402發(fā)生EMT,TGF-β1作為該信號的關(guān)鍵環(huán)節(jié)可能是干預(yù)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移新的有效靶點。
【圖文】：

圖 1：擴增的ECM1；M菌落的PCR鑒定結(jié)果，，圖片中可見一條與預(yù) 5）。鑒定 M：Maker；1-7：挑鑒定切重組質(zhì)粒后用1％瓊 627 bp)，表明ECM1基

Marker；2：EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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本文編號：2544593