【摘要】：研究背景及目的肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥致死的主要原因。肺腺癌(ADC)是肺癌的主要常見亞型。其中轉(zhuǎn)移和侵襲是肺腺癌治療中的巨大挑戰(zhàn)。然而,基于轉(zhuǎn)移和侵襲的分子機(jī)制是非常復(fù)雜的并且涉及多種分子和通路。肝X受體(LXRα/NR1H3和LXRβ/NR1H2)是一種核受體,它的作用是作為配體-激活的轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)脂代謝和炎癥。LXR可以被天然配體羥基膽固醇類物質(zhì)(如25羥基膽固醇和27羥基膽固醇)激活,也可以被合成的激活劑激活如T0901317(半數(shù)效應(yīng)濃度為50nM)。25羥基膽固醇(25-HC)和27羥基膽固醇(27-HC)是兩種羥基膽固醇類物質(zhì),是在多種組織器官中由膽固醇羥化酶催化而來的LXR配體。25-HC是一種有效的LXR介導(dǎo)的通路調(diào)節(jié)劑,參與體內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、炎癥和免疫反應(yīng)。此外,25-HC還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān),如抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、前列腺癌和前列腺癌異種移植物的細(xì)胞增殖。有研究表明,人體內(nèi)基礎(chǔ)水平的27-HC即能表現(xiàn)出顯著的ER和LXR部分激動(dòng)劑活性。除此之外,27-HC能夠通過激活受體明顯促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移,但是在黑色素瘤中,LXR的激活能抑制其轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)旨在研究25-HC和27-HC是否影響肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲,并探索其機(jī)制,為臨床肺腺癌治療提供新的依據(jù)。研究方法實(shí)驗(yàn)本研究中,我們使用人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549或NCL-H1975(上室)和人單核細(xì)胞THP1細(xì)胞(下室)創(chuàng)立了單培養(yǎng)和共培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)羥基膽固醇對(duì)肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。為了排除羥基膽固醇對(duì)細(xì)胞增殖的影響,首先通過細(xì)胞增殖實(shí)來評(píng)估羥基膽羥基膽固醇對(duì)細(xì)胞增殖的影響,為遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)選擇合適的濃度。實(shí)驗(yàn)我們選擇了0.1μM的25-HC、1μM的27-HC和50nM的T0901317用于接下來的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn),將ADC細(xì)胞種在6孔板中培養(yǎng)過夜,隨后用無菌的200μL槍頭在單層細(xì)胞上劃出一條約1mm寬的線性劃痕區(qū)。在單培養(yǎng)組中,分別向培養(yǎng)系統(tǒng)中加入上述各種藥物;在共培養(yǎng)系統(tǒng)中,加入的上清來自已經(jīng)用藥物作用24小時(shí)的THP1分化的巨噬細(xì)胞。分別與0小時(shí)和24小時(shí)在相應(yīng)位置拍照。對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn),懸于無血清培養(yǎng)基中的ADC細(xì)胞加入上室,含有上述藥物的完全培養(yǎng)基加入下室。根據(jù)說明書使用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)從單培養(yǎng)和共培養(yǎng)系統(tǒng)中收集的上清液細(xì)胞因子(IL-1β和TGF-β1)含量。最后,使用免疫印跡(Western blotting)分析檢測(cè)蛋白LXR和Snail的表達(dá)量。結(jié)果1.在0.1μM濃度時(shí),25-HC對(duì)細(xì)胞增殖沒有影響,但是從濃度1μM到25μM,25-HC能抑制兩種肺腺癌細(xì)胞的增殖,并且成劑量依賴性。對(duì)于27-HC,在0.1μM和1μM濃度時(shí)沒有影響,但在10μM到50μM濃度時(shí)有促進(jìn)作用。T0901317對(duì)于這兩種肺腺癌細(xì)胞增殖均沒有影響。2.在單培養(yǎng)系統(tǒng)中,羥基膽固醇(0.1μM的25-HC;1μM的27-HC)能夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲過程。在共培養(yǎng)系統(tǒng)中,兩種肺腺癌細(xì)胞的劃痕愈合過程都顯著加速。此外,LXR的激動(dòng)劑T0901317與羥基膽固醇有相同的效應(yīng)。3.ELISA結(jié)果顯示,THP1分化的巨噬細(xì)胞在加入羥基膽固醇后減少了 IL-1β和TGF-β1的分泌。有趣的是,在巨噬細(xì)胞和ADC細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中,IL-1β的基礎(chǔ)分泌量增加,加入羥基膽固醇后,對(duì)IL-1β釋放產(chǎn)生促進(jìn)作用。這與單培養(yǎng)組的趨勢(shì)完全不同。3.加入羥基膽固醇后,單培養(yǎng)系統(tǒng)中的LXR和Snail表達(dá)量增加,此過程在共培養(yǎng)系統(tǒng)中更加明顯。4.IL-1β能促進(jìn)兩種ADC細(xì)胞的遷移和侵襲,還能上調(diào)蛋白Snail的表達(dá),但對(duì)LXR沒有影響。5.敲除LXR之后顯著抑制兩種培養(yǎng)系統(tǒng)中25HC介導(dǎo)的Snail表達(dá),但對(duì)IL-1β介導(dǎo)的Snail表達(dá)沒有作用。6.敲除LXR后阻斷了 25HC引起的ADC細(xì)胞遷移和侵襲,但不影響IL-1β誘導(dǎo)的ADC細(xì)胞的遷移和侵襲。結(jié)論在這次研究中,我們發(fā)現(xiàn)25-HC在0.1μM濃度時(shí)不影響肺腺癌細(xì)胞增殖;隨著濃度升高,25HC抑制細(xì)胞增殖。除此之外,25HC還能夠在不影響細(xì)胞增殖的情況下促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲,尤其是在和THP-1分化的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系中表現(xiàn)更加明顯。與此同時(shí),25HC的受體LXR的表達(dá)量也相應(yīng)提高。在敲除LXR之后,25HC對(duì)ADC細(xì)胞的遷移和侵襲不再產(chǎn)生促進(jìn)效應(yīng),且Snail的表達(dá)量也不再升高。以此可得出結(jié)論:25HC可以通過激活LXR的方式促進(jìn)肺腺癌轉(zhuǎn)移。我們還發(fā)現(xiàn),25HC都能夠在共培養(yǎng)系統(tǒng)中顯著地刺激IL-1β的分泌,并能增加腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志性蛋白Snail的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),IL-1β模擬了 25HC對(duì)ADC細(xì)胞遷移和侵襲以及Snail蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用,敲除LXR后,25HC的這種促進(jìn)效應(yīng)被阻斷,但I(xiàn)L-1β的促進(jìn)作用沒有受到影響,我們的這些研究結(jié)果表明,25-HC在單一培養(yǎng)中是依賴LXR促進(jìn)ADC細(xì)胞遷移和侵襲的,共培養(yǎng)體系中25-HC誘導(dǎo)的IL-1β分泌能以不依賴LXR的方式加速ADC細(xì)胞遷移和侵襲。27HC的作用結(jié)果顯示,濃度小于1μM時(shí),27HC不影響ADC細(xì)胞增殖,隨著濃度增加,產(chǎn)生了與25HC相反的效果,即促進(jìn)細(xì)胞增殖。LXR的激動(dòng)劑T0901317在50nM到10μM濃度范圍內(nèi)對(duì)癌細(xì)胞增殖沒有影響。在不影響細(xì)胞增殖的情況下,27HC、T0901317均促進(jìn)了 ADC細(xì)胞遷移和侵襲,上調(diào)蛋白Snail和LXR的表達(dá),促進(jìn)共培養(yǎng)組IL-1β的分泌,與25HC的結(jié)果相一致。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2544035