【摘要】：研究背景及目的腎臟細胞癌在成人腫瘤中占3%,占腎臟惡性腫瘤的85%左右。是繼前列腺癌和膀胱癌之后的第三位泌尿系腫瘤,具有非常高的死亡率,大約40%。透明細胞癌是腎臟細胞癌中最常見的亞型,約占全部腎細胞癌的70-80%。除了外科手術切除之外,腎細胞癌對化療及放療均不太敏感。目前由于缺乏早期診斷及后期隨訪的有效生物標記物,導致部分疾病被發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)是晚期或者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移而預后不良,轉(zhuǎn)移患者5年生存率低于25%。因此,加強對腎透明細胞癌轉(zhuǎn)移機制的研究顯得非常急迫而重要,試圖找到能夠預測術后早期轉(zhuǎn)移和病情進展的生物標記物及抑制癌細胞轉(zhuǎn)移的方法勢在必行。目前,由于基因組測序相關技術的飛速發(fā)展,非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本沖擊著研究者的視野,部分非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)在腎癌疾病發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的作用,特別是長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)的出現(xiàn),在基因表達調(diào)控、染色體修飾等過程中發(fā)現(xiàn)了以前未被認識的功能。基于腫瘤分子生物學特點的最新研究進展,較好的方法之一是對例lncRNA表達譜的分析及相關研究。逐漸揭示lncRNA在腫瘤發(fā)病與進展中的功能和作用。研究方法(1)腎透明性細胞癌組織樣本測序:對伴有淋巴結或遠處轉(zhuǎn)移的腎透明細胞癌3例與不伴淋巴結和遠處轉(zhuǎn)移的腎透明細胞癌3例測序,分析出表達差異長鏈非編碼RNA(lncRNA)。(2)擴大臨床樣本對篩選的長鏈非編碼RNA進行驗證,篩選出差異表達最明顯的長鏈非編碼RNA。(3)臨床樣本中驗證篩選出的長鏈非編碼RNA與腎透明細胞癌轉(zhuǎn)移的相關性。(4)進行l(wèi)ncRNA干擾序列的設計與過表達全長的擴增。設計出干擾序列進行細胞轉(zhuǎn)染,同樣采用熒光定量PCR法,獲取Cp值,檢驗干擾效率,干擾效率達到70%左右視為干擾有效。(5)lncRNA功能實驗:選取兩種腎臟透明細胞癌系,分別干擾和過表達LncRNA后行細胞侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖、凋亡等功能性研究。采用樣本均數(shù)t檢驗、重復測量等統(tǒng)計方法分析差異表達情況。(6)體內(nèi)實驗:干擾或過表達lncRNA后,包裝慢病毒,轉(zhuǎn)染腎透明細胞癌系細胞,裸鼠尾靜脈注射,研究腎透明細胞癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移特點。觀察腎細胞癌轉(zhuǎn)移的成功率。(7)干擾或過表達lncRNA后,通過生物學信息分析、查找文獻或測序?qū)ふ襩ncRNA的靶蛋白或靶基因,進行轉(zhuǎn)移機制研究。分析出轉(zhuǎn)移機制中與lncRNA具有相關性的靶蛋白或靶基因。研究結果(1)成功篩選出與腎透明細胞癌轉(zhuǎn)移相關的長鏈非編碼RNA,命名為MRCCAT1(metastatic renal clear cell carcinoma-associated transcript 1)。擴大的臨床樣本驗證實驗結果顯示MRCCAT1在轉(zhuǎn)移性腎透明細胞癌中高表達,并且其表達量與患者預后負相關。(2)臨床樣本中發(fā)現(xiàn),MRCCAT1和NPR3在腎透明細胞癌組織中的表達的負相關性。(3)上調(diào)MRCCAT1可以增加腎透明細胞癌細胞系的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲能力,下調(diào)MRCCAT1則可以使腎透明細胞癌細胞系的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲能力下降。(4)在裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型實驗中進一步證實了下調(diào)MRCCAT1可以降低腎透明細胞癌細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。(5)聯(lián)合MRCCAT1和NPR3過表達實驗結果證實NPR3為MRCCAT1下游靶基因,同時明確了MRCCAT1通過抑制NPR3參與了P38-MAPK通路。(6)MRCCAT1通過抑制NPR3進而促進腎透明細胞癌細胞系的轉(zhuǎn)移能力。MRCCAT1通過與EZH2結合促進H3K27甲基化進而抑制NPR3啟動子區(qū)域。結論MRCCAT1通過與EZH2結合進而抑制NPR3表達并參與了P38-MAPK通路,最終促進腎透明細胞轉(zhuǎn)移。高表達MRCCAT1的腎透明細胞癌病人預后不良。因此,MRCCAT1有可能成為腎透明細胞癌轉(zhuǎn)移的標志物及治療靶點。
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.11

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