【摘要】：背景與目的:環(huán)狀RNA(circ RNA)是一組3'和5'端結(jié)合在一起的共價(jià)閉合環(huán)形成的非編碼轉(zhuǎn)錄本。Circ RNA如源自外顯子,則形成外顯子環(huán)狀RNA;如源自內(nèi)含子,則形成內(nèi)含子環(huán)狀RNA。他們還可以源自外顯子與保留在外顯子之間的內(nèi)含子形成環(huán)形,被稱為外顯子-內(nèi)含子Circ RNA(EIci RNAs)。也有一些證據(jù)表明,一些circ RNAs可以與RNA結(jié)合位點(diǎn)蛋白相結(jié)合,形成RNA-蛋白復(fù)合體調(diào)控其活性。例如,circ RNA可以與RNA聚合酶II和AGO蛋白結(jié)合。Circ RNA的含量也可以由包括Ago2介導(dǎo)裂解等Ago2依賴沉默機(jī)制所調(diào)控。就疾病相關(guān)性而言,circ RNA基因座中反義非編碼RNA(c ANRIL)可以調(diào)控INK4/ARF的表達(dá),從而增加動脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。circ RNA與mi R-7結(jié)合,也可能與帕金森病和癌癥的發(fā)展相關(guān),但這需要進(jìn)一步探討。Circ RNA是否與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)?在前期實(shí)驗(yàn)中,我們篩查了多種circ RNA在腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞中的含量,發(fā)現(xiàn)circ-Amotl1(circular angiomotin like 1)在腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于非腫瘤細(xì)胞系。因此,本項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)中,我們主要研究circ-Amotl1與腫瘤細(xì)胞惡性行為之間的關(guān)系。主要方法:首先,將circ-Amotl1載體和無序?qū)φ战M載體,以及抗circ Amotl1 si RNA-1、si RNA-2和Olig轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染入乳腺腫瘤細(xì)胞系MDA-MB-231,檢測circ-Amotl1在體內(nèi)外對乳腺腫瘤細(xì)胞生長的影響;接著,建立單一circ-Amotl1(circ-Amotl1-c)高表達(dá)細(xì)胞系,通過單細(xì)胞增殖試驗(yàn)、單細(xì)胞軟瓊脂克隆試驗(yàn)、單細(xì)胞動物試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)方法,進(jìn)一步檢測circ-Amotl1高表達(dá)對腫瘤生長的影響;最后,通過熒光原位雜交試驗(yàn)、免疫沉淀試驗(yàn)、Western免疫印跡試驗(yàn)、Northern免疫印跡試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)方法探討circ-Amotl1促進(jìn)腫瘤生長的機(jī)制,特別是circ-Amotl1與原癌基因之間的聯(lián)系。主要結(jié)果:1.Circ-amotl1對腫瘤細(xì)胞生長的影響(1)人乳腺腫瘤標(biāo)本中circ-Amotl1水平明顯高于相鄰正常組織。我們還檢測了多種腫瘤細(xì)胞系(MCF-7,SK-Br-3,HTB-126,MDA-MB-468,MDA-MB-231,He La,JHH-1,and U87)和非腫瘤細(xì)胞系(Ha Ca T和MCF-10A),證實(shí)在腫瘤細(xì)胞系中circ-Amotl1表達(dá)水平明顯高于非腫瘤細(xì)胞系。(2)我們將circ-Amotl1表達(dá)載體和無序?qū)φ战M控制載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染于人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231。實(shí)驗(yàn)證實(shí),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力和無血清條件下細(xì)胞生存能力顯著高于對照組。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)中形成較大克隆,在腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的侵襲能力。2.Circ-Amotl1促進(jìn)腫瘤生長(1)我們在裸鼠皮下注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染circ-Amotl1表達(dá)載體和對照組控制載體的MDA-MB-231細(xì)胞。注射后17 d,大腫瘤被切除。此外,我們發(fā)現(xiàn)腫瘤組織和基底組織之間有粘連。HE染色顯示,腫瘤細(xì)胞廣泛侵入周圍肌肉組織和骨組織。重復(fù)上述試驗(yàn),得到相同實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過腫瘤切片TUNEL染色,發(fā)現(xiàn)對照組腫瘤中死亡細(xì)胞比較多,而實(shí)驗(yàn)組腫瘤中幾乎沒有死亡細(xì)胞。CD34染色,實(shí)驗(yàn)組切片可見明顯深染色的血管內(nèi)皮影像,對照組不明顯。另外,我們在實(shí)驗(yàn)組切片中發(fā)現(xiàn)骨組織內(nèi)有腫瘤細(xì)胞和血管組織,從而導(dǎo)致骨組織被侵蝕,這種現(xiàn)象在對照組中沒有發(fā)現(xiàn)。(2)為了更好理解circ-Amotl1成瘤性功能,我們從瓊脂糖凝膠集落試驗(yàn)中選擇單細(xì)胞形成的集落進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),從而形成均勻細(xì)胞群體(circ-Amotl1-c)。這種做法可以提高細(xì)胞群體的均一性。單細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果表明一個(gè)circ-Amotl1高表達(dá)的細(xì)胞10 d內(nèi)可以增殖為11,250個(gè)細(xì)胞,是對照組細(xì)胞的30倍。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的倍增時(shí)間是15到18 h,遠(yuǎn)高于我們已知的癌癥細(xì)胞倍增時(shí)間。在單細(xì)胞軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)中,接種后第12 d,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量是對照組的142倍。(3)為了進(jìn)一步研究細(xì)胞的腫瘤形成能力,我們分別將單細(xì)胞培養(yǎng)在軟瓊脂糖膠中6 d(約219個(gè)細(xì)胞)、3 d(約9個(gè)細(xì)胞)形成的克隆接種在裸鼠皮下,同時(shí),對照組細(xì)胞接種于裸鼠皮下。最終結(jié)果:6 d克隆組和3 d克隆組裸鼠均100%形成腫瘤,對照組沒有形成任何腫瘤。(4)最后,我們在裸鼠背上接種單細(xì)胞:每次注射一個(gè)細(xì)胞。一些細(xì)胞在接種后20 d開始形成肉眼可見腫瘤。我們在180個(gè)接種點(diǎn)收集60個(gè)腫瘤。相對于單細(xì)胞接種轉(zhuǎn)移預(yù)試驗(yàn)成功率約為80%,表明有41%單細(xì)胞接種后形成腫瘤。以上結(jié)果表明,每一個(gè)circ-Amotl1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞都有形成腫瘤的潛力。而其親代MDA-MB-231細(xì)胞,需要1x107個(gè)細(xì)胞經(jīng)過30 d才能形成腫瘤。結(jié)果顯示,MDA-MB-231的致瘤性被circ-Amotl1的過表達(dá)重組為腫瘤激增細(xì)胞。最顯著的特點(diǎn)是其快速增殖能力和全部細(xì)胞不分化現(xiàn)象。3.Circ-Amotl1促進(jìn)腫瘤生長機(jī)制C-myc轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控多種致癌基因表達(dá),為了進(jìn)一步研究circ-Amotl1高成瘤性現(xiàn)象機(jī)制,我們檢測了circ-Amotl1和c-myc間的潛在聯(lián)系。(1)為了證實(shí)circ-Amotl1可以下調(diào)c-myc表達(dá)水平,反之亦然。我們通過Northern免疫印跡法試驗(yàn),檢測c-myc結(jié)合circ-Amotl1的能力。當(dāng)circ-Amotl1和探針的總輸入相同,實(shí)驗(yàn)組與對照組相比較,鏈親和素包被磁珠能夠與實(shí)驗(yàn)組circ-Amotl1結(jié)合。反之,以此探針與c-myc進(jìn)行試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)組中更多的c-myc被結(jié)合。(2)通過realtime-PCR試驗(yàn)分析了circ-Amotl1表達(dá)載體和對照組載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中c-myc目的蛋白含量,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染circ-Amotl1表達(dá)載體的細(xì)胞中c-myc目的蛋白含量增高。利用引物放大啟動子分析circ-Amotl1在c-myc及其啟動子之間互動的作用時(shí),發(fā)現(xiàn)circ-Amotl1異位表達(dá)強(qiáng)化了c-myc與部分啟動子(HIF-1,Cdc25a,ELK-1,and JUN)之間的結(jié)合能力。(3)將circ-Amotl1表達(dá)載體和對照組載體轉(zhuǎn)染無c-myc細(xì)胞系HO15.19,驗(yàn)證c-myc對于circ-Amotl1功能的影響。雖然轉(zhuǎn)然后的細(xì)胞中circ-Amotl1仍然顯著高表達(dá),然而細(xì)胞增殖試驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組與對照組無明顯差異,明確c-myc在circ-Amotl1實(shí)現(xiàn)功能中的重要作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果,我們進(jìn)行了circ-Amotl1沉默試驗(yàn)。我們采用針對circ-Amotl1的探針檢測,circ-Amotl1被沉默后,circ-Amotl1 m RNA及c-myc蛋白表達(dá)水平顯著下降。接著我們檢測了c-myc結(jié)合蛋白,circ-Amotl1被沉默后這些蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)。(4)分別檢測細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中circ-Amotl1含量,發(fā)現(xiàn)相對于細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞核內(nèi)外來circ-Amotl顯著高表達(dá)。沉默circ-Amotl1后重復(fù)Wester印記法試驗(yàn),得到相反結(jié)論。共聚焦顯微鏡分析,對照組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi),c-myc主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),而circ-Amotl1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,c-myc主要分布在細(xì)胞核內(nèi)。借助circ-Amotl1特異性探針,我們探測到circ-Amotl1和c-myc都大多分布于實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核內(nèi)。沉默circ-Amotl1后,c-myc重新分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。綜上所述,我們研究表明細(xì)胞內(nèi)circ-Amotl1高表達(dá)可引起c-myc核易位。有研究表明c-myc在細(xì)胞核內(nèi)易降解。而在我們的研究中,c-myc易位于細(xì)胞核內(nèi),而總量并未降低。這表明,在circ-Amotl1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,c-myc和circ-Amotl1共存于細(xì)胞核內(nèi),避免了c-myc被降解。結(jié)論1.乳腺癌組織中circ-Amotl1表達(dá)高于周圍正常乳腺組織。2.Circ-Amotl1促進(jìn)細(xì)胞增殖,circ-Aomtl1載體轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞倍增時(shí)間約為16h,遠(yuǎn)高于對照組倍增時(shí)間26h,增殖能力強(qiáng)于目前已經(jīng)發(fā)表的其他研究結(jié)果,且細(xì)胞增殖過程中不分化。3.Circ-Aomtl1促進(jìn)細(xì)胞成瘤,circ-Aomtl1載體轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行裸鼠成瘤試驗(yàn),荷瘤鼠腫瘤生長迅速,5×106個(gè)細(xì)胞注射裸鼠,5d形成肉眼可見腫瘤,17d裸鼠不能負(fù)擔(dān)腫瘤而被處死;3 d克隆(約9個(gè)細(xì)胞)、6 d克隆(約219個(gè)細(xì)胞)注射裸鼠試驗(yàn),成瘤率100%;單細(xì)胞注射動物試驗(yàn)表明,單細(xì)胞即能形成腫瘤,成瘤率41%。4.高成瘤能力機(jī)制表現(xiàn)為,c-myc易位于細(xì)胞核內(nèi),circ-Amotl1可以阻止c-myc被降解,使得c-myc充分發(fā)揮致癌作用。
【圖文】：

圖 2.1 circ-Amotl1 在不同細(xì)胞系中的表達(dá)Figure 2.1 Expression of circ-Amotl1 was analyzed in a variety ofcell lines by real-time PCR 人類乳腺腫瘤組織及正常乳腺組織中 circ-Amotl1 表達(dá)Realtime-PCR 結(jié)果顯示，腫瘤中 Circ-Amotl1 表達(dá)明顯高于周圍正常組 2.2 所示。

圖 2.1 circ-Amotl1 在不同細(xì)胞系中的表達(dá)gure 2.1 Expression of circ-Amotl1 was analyzed in a varietcell lines by real-time PCR乳腺腫瘤組織及正常乳腺組織中 circ-Amotl1 表達(dá)me-PCR 結(jié)果顯示，腫瘤中 Circ-Amotl1 表達(dá)明顯高于周圍示。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：2538823