【摘要】：[背景及目的]乙型肝炎病毒(HBV)引起的慢性感染是肝癌發(fā)生的主要危險因素。文獻(xiàn)報道及我們前期研究證明HBV感染可誘導(dǎo)IL-23和IP-10的表達(dá),且在HBV感染的病人血清以及組織中呈高表達(dá)。已有報道表明某些細(xì)胞因子,如IL-23能促進(jìn)細(xì)胞的增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移等,發(fā)揮著促腫瘤的作用；IL-23及IP-10等細(xì)胞因子亦能促進(jìn)T細(xì)胞的浸潤,發(fā)揮免疫應(yīng)答功能,抑制腫瘤生長。HNF4α是肝細(xì)胞分化因子,在肝臟、腎以及小腸的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。而HNF4α與炎癥密切相關(guān),是諸多細(xì)胞因子的靶分子,IL-1、IL-6及TNF等細(xì)胞因子對其表達(dá)以及活性均有影響。IL-23或IP-10是否在HBV感染引起的慢性炎癥中影響HNF4α的表達(dá),以及對肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探討HBV誘導(dǎo)IL-23、IP-10及其受體在不同肝細(xì)胞中的表達(dá)對肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制,為以其為靶點(diǎn)的腫瘤干預(yù)策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。[方法]1. HepG2以及HepG2.215細(xì)胞系中細(xì)胞因子表達(dá)的檢測HepG2和HepG2.215中細(xì)胞炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF、IL-23、HMGB1、 IL-17以及IL-33)的表達(dá)采用RT-PCR檢測。2.不同肝細(xì)胞系中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78、肝細(xì)胞分化相關(guān)分子HNF4α以及HNF4α靶基因G6Pase表達(dá)的檢測1)肝細(xì)胞系L02、HepG2、Huh-7以及]HepG2.215中GRP78、HNF4α和G6Pase mRNA水平的表達(dá)采用RT-PCR檢測；2)肝細(xì)胞系LO2、HepG2、Huh-7以及HepG2.215中GRP78和HNF4α蛋白水平的表達(dá)采用Western Blot檢測。3.肝癌細(xì)胞HBV瞬時轉(zhuǎn)染后GRP78以及]HNF4α表達(dá)的檢測1) HepG2瞬時轉(zhuǎn)染HBV24h、48h以及72h后GRP78和HNF4a mRNA的表達(dá)采用RT-PCR檢測；2) HepG2和Huh-7瞬時轉(zhuǎn)染HBV72h后GRP78和HNF4a蛋白水平的表達(dá)采用Western Blot檢測。4.檢測IL-23受體(IL-23R)以及IP-10受體(CXCR3)在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)1)肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh-7和HepG2.215中IL-23R的表達(dá)采用RT-PCR檢測;2) HepG2和HepG2.215細(xì)胞中IL-23R以及CXCR3的表達(dá)采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測;3) HepG2、Huh-7和HepG2.215細(xì)胞中IL-23R以及CXCR3的表達(dá)采用免疫熒光檢測;5.肝癌組織標(biāo)本中CXCR3的表達(dá)采用細(xì)胞免疫組化法(組織切片)檢測6.細(xì)胞因子對肝癌細(xì)胞生物學(xué)影響實(shí)驗(yàn)1)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：不同濃度IL-23或IP-10 (0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml, 40ng/ml)刺激細(xì)胞48h后,CCK-8檢測細(xì)胞增殖率；2)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)：不同濃度IL-23或IP-10 (0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml, 40ng/ml)刺激細(xì)胞24h后,固定過夜,PI染色后流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞周期變化：3)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：無血清狀況下加入不同濃度的IL-23或IP-10 (0ng/ml,5ng/ml, 1 Ong/ml,20ng/ml,40ng/ml)培養(yǎng)細(xì)胞48h, AnnexinV-FITC和P1染色,FCM檢測細(xì)胞凋亡；4)細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞接種至六孔板,IL-23 (0ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)或IP-10 (0ng/ml,10ng/ml,40ng/ml)培養(yǎng)細(xì)胞5～7天,結(jié)晶紫染色；5)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞單層鋪滿孔板,刮去部分細(xì)胞,加入不同濃度IL-23 (Ong/ml,20ng/ml,40ng/ml)或IP-10 (0ng/ml,10ng/ml,40ng/ml)培養(yǎng),觀察劃痕處細(xì)胞生長情況；6)細(xì)胞趨化侵襲實(shí)驗(yàn)：用Transwell法檢測不同濃度的IP-10 (0ng/ml,10ng/ml, 20ng/ml,40ng/ml)處理后肝癌細(xì)胞的趨化能力；采用Transwell檢測不同濃度IL-23或IP-10 (0ng/ml,5ng/ml,1 Ong/ml,20ng/ml,40ng/ml)處理后肝癌細(xì)胞的侵襲能力；7.IL-23或IP-10作用于肝癌細(xì)胞系后HNF4a表達(dá)的檢測1)不同比例的HepG2.215上清加或不加IP-10抗體(0μg/ml,0.5μ/ml,1μg/ml, 2μg/ml,4μg/ml)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞24h后,HepG2細(xì)胞中HNF4α的表達(dá)采用用Western Blot檢測；2)不同濃度IL-23或IP-10 (0ng/ml,5ng/ml,10ng/m,20ng/ml,40ng/ml)處理24h后,肝癌細(xì)胞系中HNF4α的表達(dá)采用Western Blot檢測。8.IL-23或IP-10作用于肝癌細(xì)胞系后相關(guān)基因及CD133表達(dá)的檢測1)不同濃度IL-23或IP-10 (0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)處理24h后肝癌細(xì)胞系中相關(guān)基因的表達(dá)采用Realtime PCR檢測；2)不同濃度IL-23或IP-10 (0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)處理24h后肝癌細(xì)胞系中CD133的表達(dá)采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測。9.肝癌細(xì)胞中細(xì)胞因子及其配體信號激活通路的檢測不同濃度IL-23或IP-10 (0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)刺激肝癌細(xì)胞24h后,STAT3蛋白的磷酸化形式p-STAT3、AKT蛋白的磷酸化形式p-AKT、HNF4α、E-cadherin以及GRP78的表達(dá)采用Western Blot檢測。[結(jié)果]1.肝癌細(xì)胞系及組織中細(xì)胞因子及其受體的表達(dá)：肝癌細(xì)胞系HepG2中所檢測的細(xì)胞因子低表達(dá),HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞系HepG2.215中炎性因子TN、IL-23、HMGB1以及IL-1β表達(dá)增加,以IL-23的表達(dá)增加最為明顯；肝癌細(xì)胞系中均具有IL-23R以及CXCR3的表達(dá)；2.不同肝細(xì)胞系中HNF4α、GRP78以及G6Pase的表達(dá)：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,肝癌細(xì)胞系中均有HNF4α、GRP78以及G6Pase mRNA的表達(dá),并且在HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2.215中其表達(dá)則降低；HepG2.215細(xì)胞中GRP78蛋白的表達(dá)亦降低,HNF4α蛋白的表達(dá)明顯降低；肝癌細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染HBV 24h、48h以及72h時GRP78和HNF4α的表達(dá)：結(jié)果表明瞬時轉(zhuǎn)染HBV 24h、48h以及72h后,GRP78和HNF4α mRNA的表達(dá)變化不明顯,而HBV瞬轉(zhuǎn)72h后,GRP78蛋白水平的表達(dá)降低,HNF4α蛋白水平的表達(dá)顯著降低；3.IL-23對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：結(jié)果表明,在一定濃度范圍內(nèi)隨著濃度的升高IL-23促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞S期阻滯、細(xì)胞修復(fù)、細(xì)胞克隆形成以及侵襲轉(zhuǎn)移,減少細(xì)胞凋亡,當(dāng)濃度達(dá)到40ng/ml時,其作用逐漸減弱;4.IP-10對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：在一定濃度范圍內(nèi)隨著濃度的升高IP-10亦能促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞S期阻滯,減少細(xì)胞凋亡;細(xì)胞修復(fù)、細(xì)胞克隆形成、細(xì)胞趨化以及侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng),且具有一定的濃度依賴性；但當(dāng)濃度達(dá)到40ng/ml時,其作用減弱；5.IL-23對HNF4α、GRP78、Bcl-2、CD 133以及MMP9表達(dá)的影響：在一定的濃度范圍內(nèi),隨著IL-23濃度的升高,]HTF4α蛋白表達(dá)降低,GRP78蛋白表達(dá)增加但沒有統(tǒng)計學(xué)差異；抗凋亡基因Bcl-2、干細(xì)胞化標(biāo)志CD133以及侵襲相關(guān)基因MMP9等mRNA表達(dá)上調(diào)；在20ng/ml時這種作用最為明顯,40ng/ml時其上調(diào)作用下降；6.IP-10對HNF4α、GRP78、Bcl-2、CD133以及MMP9表達(dá)的影響：在一定的濃度范圍內(nèi),隨著IP-10濃度升高,]ANF4α的蛋白表達(dá)降低,但對GRP78的表達(dá)具有促進(jìn)作用,在40ng/ml時其促進(jìn)作用較為明顯;抗凋亡基因BCL-2、干細(xì)胞標(biāo)志CD133以及侵襲相關(guān)基因MMP9等mRNA表達(dá)上調(diào),在lOng/ml時這種作用最為明顯,40ng/ml時其作用降低。7.不同濃度IL-23和IP-10對STAT3以及AKT活化的影響不同,IL-23在一定濃度范圍內(nèi),促進(jìn)STAT3活化,隨著濃度升高,對STAT3活化的促進(jìn)作用減弱,5ng/ml時促進(jìn)作用最為明顯,而40ng/ml時對其活性具有一定的抑制作用；IL-23對E-cadherin的表達(dá)具有一定的抑制作用,隨著IL-23濃度的升高E-cadherin的表達(dá)降低;IP-10在一定的濃度范圍內(nèi)促進(jìn)AKT活化,10ng/ml時最為明顯,隨著濃度的進(jìn)一步升高,AKT活化降低；IP-10在一定的濃度范圍內(nèi)對E-cadherin的表達(dá)具有抑制作用,10ng/ml時抑制作用最為明顯。[結(jié)論]本研究結(jié)果表明：①HBV可誘導(dǎo)炎性因子IP-10以及IL-23表達(dá),抑制HNF4a和GRP78的表達(dá),IL-23R以及IP-10的受體(CXCR3)在肝癌細(xì)胞中均有表達(dá),提示IL-23和IP-10分別可與肝癌細(xì)胞系表面相應(yīng)受體結(jié)合從而發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng);②證明在一定的濃度范圍內(nèi),隨著濃度的升高,IL-23和IP-10促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞修復(fù)、細(xì)胞克隆形成以及侵襲轉(zhuǎn)移,同時也能上調(diào)BCL-2、CD133以及MMP9等相關(guān)基因的表達(dá),降低HNF4α的表達(dá),提示IL-23以及IP-10具有促進(jìn)肝癌的作用,其作用可能與HF4α的表達(dá)降低有關(guān)；③IL-23在一定濃度范圍內(nèi),促進(jìn)STAT3活化,具有濃度依賴性,并抑制INF4α以及E-cadherin的表達(dá)；④IP-10在一定的濃度范圍內(nèi)促進(jìn)AKT活化,lOng/ml時最為明顯；IP-10在一定的濃度范圍內(nèi)對E-cadherin的表達(dá)具有抑制作用。研究結(jié)果表明,在一定的濃度范圍內(nèi)IL-23以及IP-10對腫瘤的發(fā)生具有促進(jìn)作用,提示其對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響與HNF4α表達(dá)的降低以及STAT3和AKT的活化相關(guān),為肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究提供了線索。
【圖文】：

化進(jìn)肝癌細(xì)胞ＨｅｐＧ２Ｌッ及Ｈｕｈ－７的侵襲轉(zhuǎn)移，在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度逡逑的增加，這種侵襲轉(zhuǎn)移能力遂漸X椙�，且在e希睿紓恚焓鼻窒芰ψ釙浚�，随着浓度辶x系慕徊繳�，侵袭能力蛀[ゼ豕ㄍ跡保福茫�。辶x希鈴義希桑蹋玻沖危板危玻板危矗板義希村危椋蹂鍔^a桑澹殄義希洛義希保蹋玻沖危板危玻埃掊危矗板義�；｜心S肧脁镥義希桑蹋玻常ǎ睿紓恚歟╁

本文編號：2536691