【摘要】：目的和意義軟骨肉瘤(chondrosarcoma, CHS)是一種除骨肉瘤以外的骨骼主要惡性腫瘤,但其分子病理學(xué)機制仍不清楚。從病理學(xué)上分類,軟骨肉瘤主要有四種：普通型軟骨肉瘤、去分化軟骨肉瘤、間葉型軟骨肉瘤和透明細胞軟骨肉瘤。普通型軟骨肉瘤占軟骨肉瘤的85%,對化療和放療極不敏感。目前手術(shù)切除仍然是軟骨肉瘤的主要治療方法,但因手術(shù)造成的患者殘疾和功能不全會給患者帶來嚴重的生活負擔和心理陰影。因此尋找和發(fā)現(xiàn)新的治療方法,使得軟骨肉瘤患者得到更好的預(yù)后,是刻不容緩的事情。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,分子靶向治療成為研究熱點,也將為治療軟骨肉瘤提供新的有效途徑。因此尋找新的分子靶點,對軟骨肉瘤的治療將具有重要的意義。轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT-1)是一種從斑馬魚到人類的生物中都高度保守的核內(nèi)長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,lncRNA)。MALAT-1可通過調(diào)控基因剪接、基因表達和細胞周期來發(fā)揮其生物學(xué)功能。MALAT-1最初在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者中被發(fā)現(xiàn)高表達,與高風險的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。隨后,研究表明MALAT-1在多種癌癥中高表達,如結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌和口腔鱗狀細胞癌等。這些結(jié)果表明MALAT-1具有致癌作用。然而,目前關(guān)于MALAT-1在軟骨肉瘤中的作用知之甚少。研究發(fā)現(xiàn),各種促生存信號途徑在生物過程中起著重要的作用。其中,作為一種新的腫瘤發(fā)生機制,Notch信號通路越來越受關(guān)注。然而,Notch信號通路在腫瘤的發(fā)展中可顯現(xiàn)相反的作用,如可作為腫瘤原癌基因或抑癌基因、抑制終末分化或誘導(dǎo)終末分化等。到目前為止,有4種Notch受體和5種相應(yīng)的配體在哺乳動物中被發(fā)現(xiàn),受體為Notch 1-4,而配體包括Delta-like-1 、 Jagged-1、 delta-like-4、delta-like-3和Jagged-2。近年研究表明,Notch受體或配體在多種癌癥中過表達,包括乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌等。近年來,在骨肉瘤細胞的凋亡過程中,發(fā)現(xiàn)了Notch信號通路的變化。根據(jù)軟骨發(fā)育過程中Notch信號通路的功能作用,Notch-1可被認為是軟骨祖細胞的分子標記物。然而,Notch信號通路在軟骨肉瘤細胞中的分子調(diào)節(jié)機制尚不清楚。本研究首先在軟骨肉瘤組織和細胞中,通過qRT-PCR方法檢測MALAT-1的異常表達,然后調(diào)節(jié)MALAT-1表達以觀察其對于軟骨肉瘤細胞生物學(xué)特性的影響,最后結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)手段,證實MALAT-1可通過調(diào)節(jié)Notch信號通路發(fā)揮作用,闡明MALAT-1在軟骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色及其發(fā)揮功能的分子機理,為深入理解軟骨肉瘤發(fā)病的分子機制和尋找新的分子靶向治療靶點奠定理論基礎(chǔ)。材料和方法1.臨床標本收集20例軟骨肉瘤組織和相應(yīng)20例癌旁正常組織均取自在江蘇省蘇北人民醫(yī)院行軟骨肉瘤切除手術(shù)的患者。病理類型：普通型17例,去分化型3例。組織學(xué)上他們均屬于軟骨肉瘤Ⅱ-Ⅲ級,其中有4例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。組織樣本取出后即放入液氮速凍,并于15 min內(nèi)保存至-80℃。本研究中,所有患者均簽署知情同意書,且經(jīng)江蘇省蘇北人民醫(yī)院倫理委員會批準。2.細胞培養(yǎng)培養(yǎng)軟骨肉瘤細胞CH2879、L835、JJ012和軟骨細胞TC28a2的培養(yǎng)基：RPMI1640培養(yǎng)基,其中含10%胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100 ng/mL鏈霉素。培養(yǎng)條件：370C、5% CO2、濕度飽和的培養(yǎng)箱。待細胞生長至對數(shù)生長期時用于后續(xù)實驗研究。3.載體構(gòu)建(1) MALAT-1過表達載體pcDNA-MALAT-1:根據(jù)MALAT-1序列分析結(jié)果,設(shè)計合成MALAT-1的單鏈oligo,利用PCR反應(yīng)將其插入T載體,并轉(zhuǎn)入宿主菌中擴增。提取擴增的重組T載體,測序驗證目的片段序列的正確性。將已驗證的目的片段克隆到pcDNA3.1表達載體上,即可獲得穩(wěn)定過表達MALAT-1的重組載體pcDNA-MALAT-1。(2) Notch-1過表達載體pcDNA-MALAT-1:具體方法同上,根據(jù)Notch-1序列分析結(jié)果,設(shè)計合成含Notch-1的目的片段,獲得可穩(wěn)定過表達Notch-1的載體pcDNA-Notch-1。4.干擾序列合成根據(jù)MALAT-1和Notch-1的序列分析分別設(shè)計合成相應(yīng)的干擾序列(siRNA-MALAT-1或siRNA-Notch-1),以及錯配無序序列作為對照siRNA-control。5.細胞轉(zhuǎn)染采用陽離子脂質(zhì)體法,依照LipofectaminTM 2000試劑說明書,將重組表達載體或siRNA轉(zhuǎn)染至相應(yīng)的軟骨肉瘤細胞,48 h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,熒光定量PCR和Western blot檢測目標分子(MALAT-1或Notch-1)的表達水平。6.熒光定量PCR用Trizol試劑抽提細胞和組織的總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后,使用SYBR Green染料進行PCR擴增反應(yīng)。以GAPDH表達水平作為內(nèi)參,運用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達值。7. Western blotWestern blot用于檢測Notch-1及其下游基因Hes-1、Hey-1和Hey-2的蛋白表達,以β-actin為對照。提取組織或細胞總蛋白,測定蛋白濃度且調(diào)整樣品終濃度,用于SDS-PAGE電泳,隨后進行濕法轉(zhuǎn)膜、免疫學(xué)反應(yīng)、顯色反應(yīng),拍照記錄。8.MTT檢測細胞增殖取對數(shù)生長期的細胞,接種于96孔培養(yǎng)板中,向每孔加入濃度為5mg/mL的MTT溶液10μL,37℃繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。1500 rpm離心10分鐘后棄上清,每孔加入150μLDMSO。以空白對照孔調(diào)零,酶標儀上570 nm測定每孔的吸光度,根據(jù)公式計算細胞存活率。9. Biotin-RNA pull down實驗采用Biotin-RNA pull down法檢測MALAT-1與Notch-1的結(jié)合。體外合成生物素結(jié)合的MALAT-1及MALAT-1反義鏈的轉(zhuǎn)錄本(陰性對照)。將蛋白裂解液與磁珠混合得到共沉淀的蛋白,隨后與生物素化的RNA在4℃孵育,加入磁珠室溫孵育1h。 4℃,3000 rpm離心3分鐘,棄上清,留磁珠。用結(jié)合液(含100mM NaCl)清洗5次,用于SDS-PAGE分析并銀染,選取差異條帶進行Western blot檢測。10.放線菌酮體外作用實驗用5 μg/mL的放線菌酮處理預(yù)培養(yǎng)的細胞,分別在作用3h、6h、9 h后收集細胞,Western blot檢測Notch-1的蛋白表達水平。11.裸鼠成瘤實驗分別將轉(zhuǎn)染有si-MALAT-1或si-control的JJ012細胞,或轉(zhuǎn)染有pcDNA-MALAT-1或pcDNA的CH2879細胞接種于裸鼠后背部皮下,接種細胞數(shù)約為1×105個/只,每組包括6只裸鼠。每隔2天用游標卡尺測量腫瘤的長短徑,并根據(jù)公式計算腫瘤體積。12.數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。熒光定量PCR檢測結(jié)果中各種細胞ΔCt值的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA);組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。P小于0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.MALAT-1對軟骨肉瘤細胞增殖的影響熒光定量結(jié)果顯示,軟骨肉瘤組織中MALAT-1水平是癌旁組織中的3.55倍,且差異具有顯著性。在軟骨肉瘤細胞系CH2879、L835、JJ012和對照軟骨細胞TC28a2中,熒光定量結(jié)果顯示MALAT-1在CH2879、L835和JJ012中的表達水平均高于TC28a2,且MALAT-1在JJ012細胞中的表達最高,是對照細胞中表達水平的4.05倍,而在CH2879中的表達相對較低,是對照細胞中表達水平的2.24倍。這些結(jié)果表明,MALAT-1確實在軟骨肉瘤組織和細胞中存在異常表達,揭示MALAT-1對軟骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展可能具有重要作用。為進一步探明MALAT-1在軟骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展中的重要作用,我們檢測了MALAT-1對軟骨肉瘤細胞增殖的影響。構(gòu)建MALAT-1過表達載體pcDNA-MALAT-1,并轉(zhuǎn)染CH2879細胞,熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),與對照相比,在CH2879細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA-MALAT-1后,MALAT-1的表達增加了10.02倍,表示通過瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA-MALAT-1可有效上調(diào)MALAT-1的表達。MTT法檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染pcDNA-MALAT-1后,CH2879細胞的生長速度增加了94%,差異具有顯著性。同時,我們還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染有si-MALAT-1的JJ012細胞的生長速度下降到51%,差異具有顯著性(P0.001)。以上結(jié)果顯示,過表達MALAT-1可顯著增強軟骨肉瘤細胞增殖能力,而干擾MALAT-1表達顯著降低了軟骨肉瘤細胞增殖能力。2. Notch-1信號通路在軟骨肉瘤細胞中的表達Western blot分析檢測發(fā)現(xiàn),與癌旁組織相比,軟骨肉瘤組織沉淀中Notch-1及其下游分子Hes-1、Hey-1和Hey-2的蛋白水平明顯增加(P0.05)。提取軟骨肉瘤細胞系CH2879、L835、JJ012和對照軟骨細胞TC28a2中的總蛋白,Westernblot檢測發(fā)現(xiàn),與對照細胞TC28a2中的蛋白水平相比,Notch-1及其下游分子Hes-1、 Hey-1和Hey-2在軟骨肉瘤細胞中的表達明顯增加(P0.05),且在JJ012細胞中蛋白含量最高,而在CH2879細胞中蛋白含量相對較低。以上結(jié)果表明,Notch-1在軟骨肉瘤組織和細胞中表達偏高,暗示其可能與軟骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。3. MALAT-1通過激活Notch-1信號通路促進軟骨肉瘤細胞增殖為檢測MALAT-1對Notch-1信號通路的影響,在轉(zhuǎn)染有si-MALAT-1或?qū)φ誷i-control的軟骨肉瘤細胞JJ012中檢測Notch-1的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾MALAT-1表達對Notch-1的mRNA水平無影響。但Western blot分析發(fā)現(xiàn),干擾MALAT-1降低了Notch-1的蛋白表達水平,并下調(diào)了Notch-1下游分子Hes-1、Hey-1和Hey-2的蛋白表達水平。而過表達MALAT-1可增加CH2879細胞中Notch-1及其下游Hes-1、Hey-1和Hey-2的蛋白表達水平。為進一步檢測MALAT-1對Notch-1蛋白表達的影響,我們將轉(zhuǎn)染有si-MALAT-1或si-control的JJ012細胞,用5 μg/mL的放線菌酮處理細胞,用Western blot分析Notch-1的蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾MALAT-1進一步導(dǎo)致放線菌酮引起的Notch-1降解加速。Biotin-RNA pull-down試驗是一種有效研究蛋白與RNA相互作用的試驗方法,我們將經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄的各生物素標記RNABiotin-MALAT-1和Biotin-MALAT-1 antisense分別與細胞蛋白裂解液孵育,隨后用鏈霉親和素磁珠捕獲復(fù)合物,經(jīng)洗滌去除非特異性結(jié)合后,用SDS-PAGE電泳分析后銀染。結(jié)果證實了MALAT-1可與Notch-1結(jié)合。以上結(jié)果表明,MALAT-1可通過與Notch-1的結(jié)合激活Notch-1信號通路。為檢測過表達Notch-1和干擾MALAT-1表達對細胞存活率的影響,我們將軟骨肉瘤細胞JJ012分為4組：(1) si-control; (2) si-MALAT-1; (3) si-MALAT-1+pcDNA; (4) si-MALAT-1+pcDNA-Notch-1。 MTT實驗檢測細胞存活率,結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達Notch-1逆轉(zhuǎn)干擾MALAT-1表達導(dǎo)致的細胞存活率下降。進一步將軟骨肉瘤細胞CH2879分為4組:(1) pcDNA; (2) pcDNA-MALAT-1; (3)pcDNA-MALAT-1+si-control; (4) pcDNA-MALAT-1+si-Notch-1, MTT實驗檢測細胞存活率。實驗表明,干擾Notch-1表達逆轉(zhuǎn)過表達MALAT-1導(dǎo)致的細胞存活率增加。這些結(jié)果揭示,MALAT-1是通過激活Notch-1信號通路促進軟骨肉瘤細胞增殖。4.在體研究MALAT-1對軟骨肉瘤細胞增殖的影響建立軟骨肉瘤細胞裸鼠移植瘤模型,在體研究MALAT-1對軟骨肉瘤細胞成瘤能力的影響。將轉(zhuǎn)染有si-MALAT-1或si-control的JJ012細胞,或轉(zhuǎn)染有pcDNA-MALAT-1或pcDNA的CH2879細胞,接種裸鼠皮下,每組6只。結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染有si-MALAT-1的JJ012細胞所形成的腫瘤體積顯著小于對照組(P0.01),表明抑制MALAT-1表達使細胞的成瘤速度顯著減慢。而過表達MALAT-1使細胞的成瘤速度顯著增加,所形成的腫瘤大小也顯著增加。結(jié)論1. MALAT-1在軟骨肉瘤組織和細胞株中表達上調(diào)。2. MALAT-1與軟骨肉瘤的發(fā)病機制有關(guān),其表達上調(diào)可促進軟骨肉瘤細胞的體外增殖能力,揭示其促癌作用。3. Notch-1信號通路在軟骨肉瘤組織和細胞株中表達上調(diào)。4.在軟骨肉瘤細胞中,MALAT-1可通過與Notch-1的結(jié)合促進Notch-1信號通路的表達。5. MALAT-1是通過激活Notch-1信號通路促進軟骨肉瘤細胞增殖。6. MALAT-1的表達失調(diào)影響癌細胞的體內(nèi)成瘤能力。
【圖文】：

法對２０例軟骨肉瘤組織中ＭＡＬＡＴ－１的表達水平與癌旁組織中的相比較，發(fā)現(xiàn)逡逑在軟骨肉瘤組織中ＭＡＬＡＴ－１相對于ＧＡＰＤＨ的平均表達水平為３．５５４，，是癌旁逡逑組織中的３．５５倍，且差異具有顯著性（Ｐ＜0．00ｌ，圖１－０。逡逑＂３邋４邐＃？＇逡逑Ｍ邐ｉｌｌ逡逑＾邐Ｉ逡逑Ｉ＇Ｊ邋Ｉ逡逑／／逡逑圖１－１軟骨肉瘤組織與癌旁組織中ＭＡＬＡＴ－１的含量逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ打邋ｏｆ邋ＭＡＬＡＴ－１邋ｉｎ邋ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍ汪邋ｔｉｓｓｕｅ邋ａｎｄ邋ｃｏｎ任0１逡逑１．２．２巧光定量ＰＣＲ檢現(xiàn)Ｕ軟骨肉瘤細胞中ＭＡＬＡＴ－１的表達逡逑提取軟骨肉瘤細胞系ＣＨ２８７９、Ｌ８３５、ＪＪ０１２和對照軟骨細胞ＴＣ２８ａ２中的逡逑１９逡逑

３種細胞株中的表達均高于內(nèi)參基因ＧＡＰＤＨ。運用２－ＡＡＣｔ法對３種軟骨肉瘤細逡逑胞株中ＭＡＬＡＴ－１的表達水平與對照軟骨細胞ＴＣ２８ａ２相比較，發(fā)現(xiàn)ＭＡＬＡＴ－１逡逑在ＣＨ２８７９、Ｌ８３５和ＪＪ０１２中的表達水平均高于ＴＣ２８ａ２邋（圖１－２），且ＭＡＬＡＴ－１逡逑在ＪＪ０１２細胞中的表達最高，是對照細胞中表達水平的４．０５倍，而在ＣＨ２８７９逡逑中的表達相對較低，是對照細胞中表達水平的２．２４倍。逡逑—Ｍｉ邋Ｓ邋廣逡逑參邐？？逡逑進邋４邋－逡逑＜邋３邐？邐占■逡逑Ｉ邐ＩＩＩ逡逑ＴＣ２８ａ２邋Ｃ把８巧邋Ｌ８３５邐ＪＪ０１２逡逑圖１－２軟骨肉墻細胞中ＭＡＬＡＴ－１的含量逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＭＡＬＡＴ－１邋ｉｎ邋ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｎｄ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑１．２．３過表達ＭＡＬＡＴ－１對軟骨肉瘤細胞增殖的影響逡逑為進一步研究ＭＡＬＡＴ－１對軟骨肉瘤細胞增殖的影響，我們構(gòu)建ＭＡＬＡＴ－１逡逑過表泣載體ｐｃＤＮＡ－ＭＡＬＡＴ－１，利用陽離子脂質(zhì)體法將ｐｃＤＮＡ－ＭＡＬＡＴ－１或?qū)﹀义险眨穑悖模危赁D(zhuǎn)染至軟骨肉瘤細胞ＣＨ２８７９中，轉(zhuǎn)染４８邋ｈ后，抽提細胞總ＲＮＡ，逡逑逆轉(zhuǎn)錄成ｃＤＮＡ，通過巧光定量Ｐ
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R738

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本文編號：2535294