【摘要】：背景:結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率在國內(nèi)外均居前五,是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一。結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個多基因累積、多步驟調(diào)控的病理過程�，F(xiàn)已明確的相關(guān)調(diào)控基因包括TP53、APC、KRAS,CTAF、CTNNB等,而隨著測序技術(shù)的發(fā)展,越來越多的研究表明,特定基因的剪切體也參與了腸癌發(fā)生發(fā)展的過程�；虻募羟畜w來源于前體mRNA的剪切,即一個前體mRNA通過不同剪切位點的組合產(chǎn)生不同mRNA轉(zhuǎn)錄本的過程。其結(jié)果導(dǎo)致一個基因能夠最終被翻譯成多種結(jié)構(gòu)相似但是功能不同的蛋白產(chǎn)物。癌變組織中特定基因的剪切體表達(dá)譜可不同于正常組織,從而影響癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。如CD44基因剪切體CD44v6在多種腫瘤中顯著升高并參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲等過程。此外CD44v6還與結(jié)直腸癌的預(yù)后相關(guān)。LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5)屬于 G 蛋白偶聯(lián)受體家族成員,主要分布在消化道系統(tǒng)、毛囊、卵巢、子宮內(nèi)膜等器官組織中。LGR5與Wnt通路高度相關(guān),而后者又是腸癌發(fā)生發(fā)展的重要通路。LGR5在腸癌中過表達(dá),其基因可被剪切成四種剪切體(Splicevariant,SPV),其中剪切體SPV1,SPV2和SPV3能被翻譯成蛋白,SPV4為非編碼mRNA,無法正常翻譯為蛋白。有研究表明,LGR5剪切體SPV1-3在正常腸粘膜組織中均能被檢測到,且在腸隱窩的不同組分中分布不同,提示其在腸道細(xì)胞分化生長過程中發(fā)揮著不同功能。然而,LGR5的不同剪切體在結(jié)直腸癌中的分布情況、臨床意義和對腸癌發(fā)生發(fā)展的功能意義尚不明確。目的:本研究通過對LGR5剪切體SPV1-3在結(jié)直腸癌臨床病例標(biāo)本中豐度的檢測,分析其與患者臨床病理特征的相關(guān)性,明確LGR5剪切體的臨床意義;之后在細(xì)胞水平探究三種剪切體對腸癌細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)行為的影響并分析相關(guān)信號通路,進一步明確其影響腸癌發(fā)生發(fā)展的具體機制。方法:Ⅰ.LGR 剪切體在腸癌中的豐度和臨床意義1.設(shè)計LGR5剪切體SPV1-3的特異性引物,用PCR法構(gòu)建三種LGR5剪切體的真核表達(dá)質(zhì)粒,用于驗證引物特異性。2.從本中心冰凍樣本庫選取93對結(jié)直腸癌和正常粘膜配對樣本,用所設(shè)計引物和RT-qPCR方法測定標(biāo)本中三種剪切體的豐度,與臨床病理特征進行相關(guān)性分析。Ⅱ.LR5剪切體的功能研究1.用RKO和HT29細(xì)胞系構(gòu)建過表達(dá)SPV1、SPV2和SPV3的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。2.通過CCK8、Transwell、劃痕愈合試驗等方法研究LGR5剪切體對腸癌細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)功能的影響。3.用蛋白免疫印跡法檢測LGR5剪切體過表達(dá)細(xì)胞系中EMT(epithelial mesenchymal transition)通路相關(guān)分子如E-cadherin、Vimentin等蛋白的表達(dá)水平以及Wnt通路中β-catenin和LRP6磷酸化水平,評估其對這兩條通路的調(diào)控。4.以Wnt通路特異性靶基因Axin2mRNA水平為檢測指標(biāo),研究不同LGR5剪切體對Wnt通路激活強度的調(diào)控。結(jié)果:Ⅰ.LGR5剪切體在腸癌中的豐度和臨床意義1.LGR5剪切體SPV1、SPV2和SPV3的mRNA豐度在結(jié)直腸癌組織(n=93)中均顯著高于正常組織(n=93)(SPV1:42.73±5.26 vs 24.60±3.34,P0.0001;SPV2:43.43±5.71 vs36.78±2.66,p=0.0041;SPV3:53.77±7.63 vs27.76±4.15,p=0.0009)。2.SPV1與患者的臨床分期、分化程度、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性(p0.05)。3.SPV2豐度在低分化腺癌中顯著高于中、高分化腺癌(SPV2:31.69±7.15vs 56.49±8.75,P=0.0367);在Ⅲ、Ⅳ期結(jié)直腸癌中顯著高于Ⅰ、Ⅱ期結(jié)直腸癌(SPV2:71.72±14.26 vs 37.10±6.03,p=0.0184);與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性(P0.05)。4.SPV3在低分化腺癌中豐度明顯高于中、高分化腺癌(97.84±24.69 vs 43.91±7.16,p=0.0057);在 Ⅲ、Ⅳ 期患者中顯著高于Ⅰ、Ⅱ期患者(74.51±13.12vs 35.14±7.64,p=0.0074);并且 SPV3 在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(75.28±14.26 vs 39.53±7.35,p=0.0138)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(71.641±12.46vs47.37±5.98,p=0.0363)中均較無轉(zhuǎn)移患者顯著增高。Ⅱ.LGR5剪切體的功能研究1.LGR5剪切體在RKO和HT29中的過表達(dá)對該兩種細(xì)胞的增殖無明顯影響。2.SPV1和SPV2在RKO和HT29細(xì)胞中過表達(dá)后能夠促進該兩種細(xì)胞的遷移,而SPV3則能抑制其遷移。3.SPV1和SPV2在RKO和HT29細(xì)胞中過表達(dá)后能夠促進EMT通路并強化Wnt通路的激活。而SPV3在該兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞中過表達(dá)則下調(diào)EMT通路相關(guān)分子并削弱Wnt通路的激活。結(jié)論:1.LGR 剪切體SPV1、SPV2和SPV3豐度在結(jié)直腸癌中顯著高于正常腸粘膜,提示其與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)。2.SPV2和SPV3與臨床病理特征的相關(guān)性方面較為相似:在低分化腺癌中顯著高于中、高分化腺癌,且SPV3還與結(jié)直腸癌的局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān);但SPV1與患者病理特征無明顯相關(guān)性。因此,SPV3或許可作為反映結(jié)直腸癌患者病理分化程度和轉(zhuǎn)移特性的標(biāo)志分子。3.SPV1和SPV2在功能上相似且與SPV3功能相反。前者能夠促進腸癌細(xì)胞的遷移,并促進EMT和Wnt通路激活,后者對該過程和通路則表現(xiàn)為抑制作用。因此SPV1和SPV2可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。SPV3在細(xì)胞中抑制轉(zhuǎn)移的功能與其在轉(zhuǎn)移性腸癌中高表達(dá)的結(jié)果不一致,原因尚不清楚,需要進一步探索。
【圖文】：

ＬＧＲ５蛋白屬于Ｇ蛋白偶聯(lián)受體家族成員，由一個較長的胞外段，一個七次逡逑跨膜區(qū)和一個較短的胞內(nèi)段組合而成。全長ＺＧ欠５由１８個外顯子編碼，共有四種逡逑剪切體（ｓｐｌｉｃｅ邋ｖａｒｉａｎｔ，邋ＳＰＹ），在此我們分別簡稱為邋ＳＰＶ１、ＳＰＶ２、ＳＰＶ３、ＳＰＶ４逡逑（困１）。其中ＳＰＶ１為全長蛋白，ＳＰＶ２缺失第２６３至２８６位氨基酸（第８外顯子），逡逑ＳＰＶ３缺失第１４３至２１４位氨基酸（第５外顯子），ＳＰＶ４缺失第１４３至２％位氨基逡逑酸（第５至第８外顯子）。只有ＳＰＶ４因剪切后移碼，導(dǎo)致無法正常翻譯為蛋白產(chǎn)逡逑物，在此不納入我們的巧究范圍。由于剪切體之間缺失特定的外顯子序列而其余逡逑序列相同，因此制備特異性抗體非常困難。另外，我們也沒有找到商業(yè)化的ＩＧ化５逡逑剪切體特異性抗體，因此無法進行免疫印跡或免疫組化分析，而只能通過設(shè)計特逡逑異性引物，使用ｑＰＣ民對其豐度進行檢測。為了能正確無誤地設(shè)計特異性引物，本逡逑部分首先克隆并構(gòu)建了邋ＳＰＶ１、ＳＰＶ２和ＳＰＶ３的質(zhì)粒，，用于檢測引物的正確性。逡逑隨后在９３對腸癌樣本中檢測不同剪切體的豐度，結(jié)合樣本的臨床數(shù)據(jù)，探究其臨逡逑床意義。逡逑ＬＧＲ５邋全長邋ＳＰＶ１逡逑

浙江大學(xué)巧N學(xué)位論文邐第一部分實驗方法逡逑例：首先Ｗ上一步獲得的ＩＧ化ＳＰＶ１為模板，分別用引物ＩＧ化５Ｆ２和ＳＰＶ２１ｉｎｋｅｒ逡逑民，Ｗ及引物ＩＧｉ？５Ｒ２和ＳＰＶ２邋１ｉｎｋｅｒＦ擴增出剪切位點前后兩個片段，并分別切逡逑膠回收得到ｆｒａｇｍｅｎｔｌ和ｆｒａｇｍｅｎｔ］，然后將５０ｎｇ的兩種片段等物質(zhì)的量比例混合逡逑作為模扳，ＷＩＧ欠５Ｆ２和ＺＧ化５民２為引物進行擴增，即獲得ＺＧ化５ＳＰＶ２。同理可逡逑得邐化５ＳＰＶ３。逡逑２．２．３．１邐ＳＰＶ１－３邋引物設(shè)計逡逑ＮＣＢＩ邋Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｅ；邋ＮＭ＿００３６６７．３邐ＢａｍＨＩ邐．逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.34

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 任秀梅;趙彥斌;孫兆增;許琴;白杰英;劉一;胡仲明;靳朝;曾林;;比格犬一種新雌激素β受體可變剪切體的克隆及鑒定[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2012年07期

2 張慧英,高杰英,羅振革,劉永全,彭虹,陳志華,孔祥英;小鼠MAdCAM-1分子剪切體的克隆及表達(dá)[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2000年04期

3 陶明亮;袁菊;成軍;靳亞平;;新基因p7TP3剪切體1的克隆與亞細(xì)胞定位[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報;2007年06期

4 尹麗;王琦;林原;成軍;;新基因XTP11剪切體的克隆與亞細(xì)胞定位[J];大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2009年04期

5 尹麗;林原;唐澤耀;成軍;;HBxAg反式調(diào)節(jié)基因11剪切體的克隆化及生物信息學(xué)分析[J];中國生化藥物雜志;2011年03期

6 孫莉,王元,沈南,鮑春德,顧越英,陳順樂;PBX1基因剪切體表達(dá)與SLE的相關(guān)研究[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2004年02期

7 張健康;郭江;成軍;王丹瓊;倫永志;趙龍鳳;藍(lán)賢勇;洪源;毛羽;;HBeAg結(jié)合蛋白4基因剪切體HBeBP4A的克隆化[J];世界華人消化雜志;2006年15期

8 成軍,楊倩,劉妍,王建軍,紀(jì)冬;丙型肝炎病毒NS5A蛋白反式調(diào)節(jié)基因2不同剪切體調(diào)節(jié)靶基因的比較[J];世界華人消化雜志;2005年02期

9 張健康;郭江;成軍;倫永志;王丹瓊;趙龍鳳;藍(lán)賢勇;洪源;毛羽;;乙型肝炎病毒e抗原結(jié)合蛋白4基因剪切體HBeBP4A的克隆與原核表達(dá)[J];中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志;2007年06期

10 張健康;成軍;郭江;劉春艷;趙龍鳳;洪源;;HBeAg結(jié)合蛋白4剪切體HBeBP4A基因酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)研究[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2007年03期

相關(guān)會議論文 前5條

1 高鵬;王平章;于鵬;彭智;彭亮;李娜;石太平;馬大龍;;TNFRSF1A新的分泌型剪切體的克隆、表達(dá)和活性驗證[A];第六屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2008年

2 黃金明;劉剛;劉月平;姚玉昌;方美英;吳常信;;豬肥胖相關(guān)基因(FTO)剪切體鑒定及其在閹割與非閹割公豬中的表達(dá)分析[A];中國動物遺傳育種研究進展——第十五次全國動物遺傳育種學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2009年

3 藍(lán)賢勇;張黎穎;成軍;袁菊;陶明亮;毛羽;藍(lán)先勇;陳宏;;HCV E2蛋白結(jié)合蛋白基因E2BP3剪切體的基因克隆化及生物信息學(xué)分析[A];第五屆全國肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

4 藍(lán)賢勇;張黎穎;成軍;袁菊;陶明亮;毛羽;陳宏;;HCV E2蛋白結(jié)合蛋白基因E2BP3剪切體的基因克隆化及生物信息學(xué)分析[A];中華醫(yī)學(xué)會全國第九次感染病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

5 張健康;成軍;郭江;倫永志;王丹瓊;趙龍鳳;洪源;毛羽;;HBeAg結(jié)合蛋白4剪切體HBeBP4A基因酵母表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會全國第九次感染病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

相關(guān)重要報紙文章 前2條

1 李天舒;人腦基因剪切體被發(fā)現(xiàn)[N];健康報;2007年

2 段文;中科院昆明動物所：發(fā)現(xiàn)人類大腦中存在特有基因剪切體[N];中國醫(yī)藥報;2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 湯揚;LGR5剪切體在結(jié)直腸癌中的臨床意義和功能研究[D];浙江大學(xué);2017年

2 高楊;人源Survivin N-端剪切體的體外生物學(xué)和譜學(xué)研究[D];吉林大學(xué);2011年

3 黃锎靚;肉鴨Myostatin剪切體的表達(dá)和調(diào)控[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

4 董瓊珠;骨橋蛋白不同剪切體及單體型在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的功能與機制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前6條

1 王亞嫻;SALL4可變剪切體的驗證及其對OTX2的調(diào)控[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

2 付楠;雞ERα基因胚胎組織表達(dá)差異及其啟動子活性分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

3 陶明亮;應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)篩選p7TP3剪切體1反式激活基因[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

4 徐婷婷;雞ERα基因啟動子的活性分析及其剪切體的時空表達(dá)研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

5 閆娜娜;草魚SARM1基因與其剪切體的克隆、表達(dá)、定位及免疫功能研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

6 李靖;TSHβ剪切體在碘過量和甲狀腺球蛋白引發(fā)NOD鼠自身免疫性甲狀腺炎的表達(dá)[D];天津醫(yī)科大學(xué);2010年

本文編號：2534968