【摘要】：背景:結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率在國內(nèi)外均居前五,是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一。結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多基因累積、多步驟調(diào)控的病理過程。現(xiàn)已明確的相關(guān)調(diào)控基因包括TP53、APC、KRAS,CTAF、CTNNB等,而隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,越來越多的研究表明,特定基因的剪切體也參與了腸癌發(fā)生發(fā)展的過程�；虻募羟畜w來源于前體mRNA的剪切,即一個(gè)前體mRNA通過不同剪切位點(diǎn)的組合產(chǎn)生不同mRNA轉(zhuǎn)錄本的過程。其結(jié)果導(dǎo)致一個(gè)基因能夠最終被翻譯成多種結(jié)構(gòu)相似但是功能不同的蛋白產(chǎn)物。癌變組織中特定基因的剪切體表達(dá)譜可不同于正常組織,從而影響癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。如CD44基因剪切體CD44v6在多種腫瘤中顯著升高并參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲等過程。此外CD44v6還與結(jié)直腸癌的預(yù)后相關(guān)。LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5)屬于 G 蛋白偶聯(lián)受體家族成員,主要分布在消化道系統(tǒng)、毛囊、卵巢、子宮內(nèi)膜等器官組織中。LGR5與Wnt通路高度相關(guān),而后者又是腸癌發(fā)生發(fā)展的重要通路。LGR5在腸癌中過表達(dá),其基因可被剪切成四種剪切體(Splicevariant,SPV),其中剪切體SPV1,SPV2和SPV3能被翻譯成蛋白,SPV4為非編碼mRNA,無法正常翻譯為蛋白。有研究表明,LGR5剪切體SPV1-3在正常腸粘膜組織中均能被檢測(cè)到,且在腸隱窩的不同組分中分布不同,提示其在腸道細(xì)胞分化生長(zhǎng)過程中發(fā)揮著不同功能。然而,LGR5的不同剪切體在結(jié)直腸癌中的分布情況、臨床意義和對(duì)腸癌發(fā)生發(fā)展的功能意義尚不明確。目的:本研究通過對(duì)LGR5剪切體SPV1-3在結(jié)直腸癌臨床病例標(biāo)本中豐度的檢測(cè),分析其與患者臨床病理特征的相關(guān)性,明確LGR5剪切體的臨床意義;之后在細(xì)胞水平探究三種剪切體對(duì)腸癌細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)行為的影響并分析相關(guān)信號(hào)通路,進(jìn)一步明確其影響腸癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制。方法:Ⅰ.LGR 剪切體在腸癌中的豐度和臨床意義1.設(shè)計(jì)LGR5剪切體SPV1-3的特異性引物,用PCR法構(gòu)建三種LGR5剪切體的真核表達(dá)質(zhì)粒,用于驗(yàn)證引物特異性。2.從本中心冰凍樣本庫選取93對(duì)結(jié)直腸癌和正常粘膜配對(duì)樣本,用所設(shè)計(jì)引物和RT-qPCR方法測(cè)定標(biāo)本中三種剪切體的豐度,與臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析。Ⅱ.LR5剪切體的功能研究1.用RKO和HT29細(xì)胞系構(gòu)建過表達(dá)SPV1、SPV2和SPV3的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。2.通過CCK8、Transwell、劃痕愈合試驗(yàn)等方法研究LGR5剪切體對(duì)腸癌細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)功能的影響。3.用蛋白免疫印跡法檢測(cè)LGR5剪切體過表達(dá)細(xì)胞系中EMT(epithelial mesenchymal transition)通路相關(guān)分子如E-cadherin、Vimentin等蛋白的表達(dá)水平以及Wnt通路中β-catenin和LRP6磷酸化水平,評(píng)估其對(duì)這兩條通路的調(diào)控。4.以Wnt通路特異性靶基因Axin2mRNA水平為檢測(cè)指標(biāo),研究不同LGR5剪切體對(duì)Wnt通路激活強(qiáng)度的調(diào)控。結(jié)果:Ⅰ.LGR5剪切體在腸癌中的豐度和臨床意義1.LGR5剪切體SPV1、SPV2和SPV3的mRNA豐度在結(jié)直腸癌組織(n=93)中均顯著高于正常組織(n=93)(SPV1:42.73±5.26 vs 24.60±3.34,P0.0001;SPV2:43.43±5.71 vs36.78±2.66,p=0.0041;SPV3:53.77±7.63 vs27.76±4.15,p=0.0009)。2.SPV1與患者的臨床分期、分化程度、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性(p0.05)。3.SPV2豐度在低分化腺癌中顯著高于中、高分化腺癌(SPV2:31.69±7.15vs 56.49±8.75,P=0.0367);在Ⅲ、Ⅳ期結(jié)直腸癌中顯著高于Ⅰ、Ⅱ期結(jié)直腸癌(SPV2:71.72±14.26 vs 37.10±6.03,p=0.0184);與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性(P0.05)。4.SPV3在低分化腺癌中豐度明顯高于中、高分化腺癌(97.84±24.69 vs 43.91±7.16,p=0.0057);在 Ⅲ、Ⅳ 期患者中顯著高于Ⅰ、Ⅱ期患者(74.51±13.12vs 35.14±7.64,p=0.0074);并且 SPV3 在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(75.28±14.26 vs 39.53±7.35,p=0.0138)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(71.641±12.46vs47.37±5.98,p=0.0363)中均較無轉(zhuǎn)移患者顯著增高。Ⅱ.LGR5剪切體的功能研究1.LGR5剪切體在RKO和HT29中的過表達(dá)對(duì)該兩種細(xì)胞的增殖無明顯影響。2.SPV1和SPV2在RKO和HT29細(xì)胞中過表達(dá)后能夠促進(jìn)該兩種細(xì)胞的遷移,而SPV3則能抑制其遷移。3.SPV1和SPV2在RKO和HT29細(xì)胞中過表達(dá)后能夠促進(jìn)EMT通路并強(qiáng)化Wnt通路的激活。而SPV3在該兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞中過表達(dá)則下調(diào)EMT通路相關(guān)分子并削弱Wnt通路的激活。結(jié)論:1.LGR 剪切體SPV1、SPV2和SPV3豐度在結(jié)直腸癌中顯著高于正常腸粘膜,提示其與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)。2.SPV2和SPV3與臨床病理特征的相關(guān)性方面較為相似:在低分化腺癌中顯著高于中、高分化腺癌,且SPV3還與結(jié)直腸癌的局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān);但SPV1與患者病理特征無明顯相關(guān)性。因此,SPV3或許可作為反映結(jié)直腸癌患者病理分化程度和轉(zhuǎn)移特性的標(biāo)志分子。3.SPV1和SPV2在功能上相似且與SPV3功能相反。前者能夠促進(jìn)腸癌細(xì)胞的遷移,并促進(jìn)EMT和Wnt通路激活,后者對(duì)該過程和通路則表現(xiàn)為抑制作用。因此SPV1和SPV2可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。SPV3在細(xì)胞中抑制轉(zhuǎn)移的功能與其在轉(zhuǎn)移性腸癌中高表達(dá)的結(jié)果不一致,原因尚不清楚,需要進(jìn)一步探索。
【圖文】：

ＬＧＲ５蛋白屬于Ｇ蛋白偶聯(lián)受體家族成員，由一個(gè)較長(zhǎng)的胞外段，一個(gè)七次逡逑跨膜區(qū)和一個(gè)較短的胞內(nèi)段組合而成。全長(zhǎng)ＺＧ欠５由１８?jìng)�(gè)外顯子編碼，共有四種逡逑剪切體（ｓｐｌｉｃｅ邋ｖａｒｉａｎｔ，邋ＳＰＹ），在此我們分別簡(jiǎn)稱為邋ＳＰＶ１、ＳＰＶ２、ＳＰＶ３、ＳＰＶ４逡逑（困１）。其中ＳＰＶ１為全長(zhǎng)蛋白，ＳＰＶ２缺失第２６３至２８６位氨基酸（第８外顯子），逡逑ＳＰＶ３缺失第１４３至２１４位氨基酸（第５外顯子），ＳＰＶ４缺失第１４３至２％位氨基逡逑酸（第５至第８外顯子）。只有ＳＰＶ４因剪切后移碼，導(dǎo)致無法正常翻譯為蛋白產(chǎn)逡逑物，在此不納入我們的巧究范圍。由于剪切體之間缺失特定的外顯子序列而其余逡逑序列相同，因此制備特異性抗體非常困難。另外，我們也沒有找到商業(yè)化的ＩＧ化５逡逑剪切體特異性抗體，因此無法進(jìn)行免疫印跡或免疫組化分析，而只能通過設(shè)計(jì)特逡逑異性引物，使用ｑＰＣ民對(duì)其豐度進(jìn)行檢測(cè)。為了能正確無誤地設(shè)計(jì)特異性引物，本逡逑部分首先克隆并構(gòu)建了邋ＳＰＶ１、ＳＰＶ２和ＳＰＶ３的質(zhì)粒，，用于檢測(cè)引物的正確性。逡逑隨后在９３對(duì)腸癌樣本中檢測(cè)不同剪切體的豐度，結(jié)合樣本的臨床數(shù)據(jù)，探究其臨逡逑床意義。逡逑ＬＧＲ５邋全長(zhǎng)邋ＳＰＶ１逡逑

浙江大學(xué)巧N學(xué)位論文邐第一部分實(shí)驗(yàn)方法逡逑例：首先Ｗ上一步獲得的ＩＧ化ＳＰＶ１為模板，分別用引物ＩＧ化５Ｆ２和ＳＰＶ２１ｉｎｋｅｒ逡逑民，Ｗ及引物ＩＧｉ？５Ｒ２和ＳＰＶ２邋１ｉｎｋｅｒＦ擴(kuò)增出剪切位點(diǎn)前后兩個(gè)片段，并分別切逡逑膠回收得到ｆｒａｇｍｅｎｔｌ和ｆｒａｇｍｅｎｔ］，然后將５０ｎｇ的兩種片段等物質(zhì)的量比例混合逡逑作為模扳，ＷＩＧ欠５Ｆ２和ＺＧ化５民２為引物進(jìn)行擴(kuò)增，即獲得ＺＧ化５ＳＰＶ２。同理可逡逑得邐化５ＳＰＶ３。逡逑２．２．３．１邐ＳＰＶ１－３邋引物設(shè)計(jì)逡逑ＮＣＢＩ邋Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｅ；邋ＮＭ＿００３６６７．３邐ＢａｍＨＩ邐．逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.34

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本文編號(hào)：2534968