發(fā)布時間：2019-09-12 04:36

【摘要】：第一部分BMSCs DNA損傷分泌蛋白的篩選及在AML耐藥中的作用鑒定研究背景：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一組遺傳學異常、治療反應和預后均有極大差異的造血系統(tǒng)惡性疾患,嚴重威害人類健康。迄今為止,以蒽環(huán)類和阿糖胞苷為主的聯(lián)合化療、新型靶向制劑以及造血干細胞移植雖較大程度改善了AML患者的生存,但仍有大部分患者因多藥耐藥而導致復發(fā)和死亡,臨床預后極差。因此,深入探究AML耐藥的發(fā)生機制及其逆轉(zhuǎn)對策對于提高AML患者療效、減少復發(fā)和改善預后具有重大臨床意義。近年研究表明,骨髓微環(huán)境與白血病細胞相互作用在白血病多藥耐藥和復發(fā)中發(fā)揮重要作用。骨髓微環(huán)境主要由骨髓基質(zhì)細胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)、細胞外基質(zhì)及各種可溶性因子構成,其中BMSCs是參與白血病細胞生存和耐藥的最重要因素。研究報道,BMSCs可通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Caspase-3,使HL60和HL60/VCR細胞對拓撲替康(TPT)的藥物敏感性下降。另有研究發(fā)現(xiàn),骨髓內(nèi)皮細胞可促進AML細胞增殖,并抑制化療藥物誘導的AML細胞凋亡。我們前期研究發(fā)現(xiàn),AML細胞可通過直接接觸的方式影響骨髓內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和小管形成,從而參與白血病細胞耐藥。由此可見,BMSCs可通過多種機制促進白血病細胞耐藥,靶向BMSCs可能會成為克服AML耐藥的有力手段。最新研究提示,化療藥物在誘導腫瘤細胞發(fā)生DNA損傷并導致其死亡或衰老的同時,也可誘導腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細胞發(fā)生DNA損傷,啟動DNA損傷反應,并激活下游細胞因子的產(chǎn)生和分泌,這些細胞因子在介導腫瘤獲得性耐藥中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),前列腺癌成纖維細胞經(jīng)化療處理后發(fā)生明顯的DNA損傷并分泌一組表達明顯升高的蛋白,其中WNT16B通過活化經(jīng)典Wnt信號通路促進前列腺癌細胞的增殖和耐藥。另有研究顯示,阿霉素治療淋巴瘤小鼠后,可誘導小鼠胸腺內(nèi)皮細胞發(fā)生DNA損傷并分泌一類影響淋巴瘤細胞生存的細胞因子,如IL-6和TIMP-1。還有研究報道,乳腺癌內(nèi)皮細胞和其它基質(zhì)細胞經(jīng)化療損傷后分泌TNF-α, TNF-α通過活化NF-κB信號通路并提高CXCL1/2的表達,最終導致乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性下降。近期研究表明,化療藥物在殺傷白血病細胞的同時,也可損傷骨髓微環(huán)境中的基質(zhì)細胞。然而,BMSCs DNA損傷后會釋放哪些分泌型蛋白,這些分泌型蛋白又是通過何種機制介導白血病細胞耐藥,目前均尚不明確,亟待進一步研究。研究目的：本課題擬研究化療藥物對BMSCs和臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs) DNA損傷的影響,并明確其分泌的條件培養(yǎng)基在AML耐藥中的作用；篩選和驗證BMSCsDNA損傷后條件培養(yǎng)基中的差異表達蛋白,并對其生物學功能和信號通路進行軟件預測分析；體外鑒定BMSCs DNA損傷分泌蛋白中參與AML耐藥的關鍵因子,并研究其在AML患者骨髓中的表達。預期揭示骨髓微環(huán)境介導AML耐藥的新機制,對克服AML耐藥、清除微小殘留病變具有重要意義。研究方法：1.化療藥物對BMSCs和HUVECs DNA損傷的影響：將骨髓基質(zhì)細胞系HS-5和HUVECs分別暴露于化療藥物阿霉素(ADR)、去甲氧柔紅霉素(IDA)和阿糖胞苷(Ara-C)以及生理鹽水(NS)24小時,細胞免疫熒光和Western blot方法檢測DNA損傷標志物γ-H2AX和PARP1的表達。2. BMSCs和HUVECs DNA損傷后條件培養(yǎng)基對AML細胞生物學行為的影響。2.1 HS-5和HUVECs DNA損傷后條件培養(yǎng)基對AML細胞藥物敏感性的影響：應用ADR、IDA和NS處理HS-5和HUVECs后的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)AML細胞,以含有0.5% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基為對照,每組分別加入不同濃度梯度的ADR和IDA,培養(yǎng)72小時后,CCK8方法檢測AML細胞相對存活率的改變。2.2HS-5 DNA損傷后條件培養(yǎng)基對AML細胞增殖的影響：應用ADR和NS處理HS-5后的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1和NB4細胞,以含有0.5% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基為對照,CCK8方法檢測細胞增殖并繪制生長曲線。3.HS-5與AML細胞直接共培養(yǎng)對AML細胞凋亡的影響：將HS-5與Kasumi-1細胞以不同比例直接共培養(yǎng),并給予ADR處理48小時,AnnexinV/PI雙染后流式細胞術檢測細胞凋亡的改變。4.IL-6、IL-8和CYR61在DNA損傷后BMSCs中的表達：ELISA方法檢測HS-5和原代骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)損傷前后的條件培養(yǎng)基中IL-6、IL-8和CYR61的蛋白表達；Real-Time RT-PCR方法檢測IL-6、IL-8和CYR61在ADR、IDA和(或)Ara-C處理后的HS-5和MSCs中的mRNA表達。5.篩選BMSCs DNA損傷后條件培養(yǎng)基中的差異表達蛋白：收集ADR和NS處理HS-5后的條件培養(yǎng)基,應用蛋白芯片技術檢測HS-5 DNA損傷前后條件培養(yǎng)基中分泌蛋白的表達情況,選取差異倍數(shù)較高的蛋白作為候選因子。6.驗證蛋白芯片結果：Real-time RT-PCR方法檢測ADR、IDA、Ara-C和NS處理后的HS-5中候選因子的mRNA表達。7.蛋白芯片結果的生物學功能和信號通路預測分析及驗證：應用相關軟件對蛋白芯片結果進行Go Term和顯著性相關信號通路分析。應用IDA和NS處理HS-5后的條件培養(yǎng)基以及含有0.5% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1和U937細胞6小時,Western blot方法對信號通路的預測分析結果進行驗證。8.候選BMSCs DNA損傷分泌蛋白在AML患者骨髓中的表達：收集144例AML患者和34例正常對照骨髓標本,應用密度梯度心法分離骨髓單個核細胞,Real-time RT-PCR方法檢測候選蛋白的mRNA:表達。9.體外鑒定BMSCs DNA損傷分泌蛋白中參與AML耐藥的關鍵因子：將AML細胞饑餓過夜培養(yǎng)后,在培養(yǎng)基中加入不同濃度的候選蛋白或中和抗體,流式細胞術和CCK8方法檢測候選蛋白對AML細胞凋亡、增殖或藥物敏感性的影響。研究結果：1.證實化療藥物可誘導BMSCs和HUVECs DNA損傷：細胞免疫熒光和Western blot結果顯示,與對照組(NS處理組)相比,γ-H2AX、PARP1在ADR、IDA或Ara-C藥物處理后HS-5或HUVECs中的蛋白表達明顯升高。2. BMSCs和HUVECs DNA損傷后條件培養(yǎng)基對AML細胞生物學行為的影響：2.1條件培養(yǎng)基對AML藥物敏感性的影響：CCK8結果顯示,在不同濃度ADR和IDA作用下,HS-5和]HUVECs DNA損傷后條件培養(yǎng)基組中AML細胞的相對存活率明顯高于未損傷組和RPMI 1640組。2.2條件培養(yǎng)基對AML細胞增殖的影響：CCK8結果顯示,ADR處理HS-5后的條件培養(yǎng)基對AML細胞的增殖無顯著影響。3.HS-5與AML細胞直接共培養(yǎng)對AML細胞凋亡的影響：流式細胞術結果顯示,HS-5與Kasumi-1細胞直接共培養(yǎng)可顯著降低ADR誘導的Kasumi-1細胞凋亡。4. IL-6、IL-8HCYR61在DNA損傷后BMSCs中的蛋白和mRNA表達：4.1ELISA結果顯示,與對照組相比,IL-6、IL-8和CYR61在ADR處理HS-5后條件培養(yǎng)基以及ADR和IDA處理MSCs后條件培養(yǎng)基中的蛋白水平未見明顯升高。4.2 Real-time RT-PCR結果顯示,與對照組相比,IL-6和IL-8在ADR和(或)IDA處理后的HS-5中的mRNA表達明顯升高,而CYR61的mRNA表達無明顯改變；與對照組相比,IL-6、IL-8和CYR61在ADR、IDA和Ara-C處理后的MSCs中的mRNA均無顯著改變。5.蛋白芯片篩選結果：應用蛋白芯片技術在ADR處理HS-5后的條件培養(yǎng)基中篩選出44個表達顯著升高的分泌蛋白,其中差異較大的細胞因子為Activin A= 6Ckine、FGF-10、Betacellulin(BTC)、EG-VEGF和growth hormone (GH),作為候選因子。6.蛋白芯片結果的驗證：Real-time RT-PCR結果顯示,與對照組相比,Activin A、 6Ckine、FGF-10、BTC、EG-VEGF和GH在化療藥物處理后的HS-5中的mRNA表達明顯升高,與芯片結果一致。7.蛋白芯片結果的生物學功能和信號通路分析及驗證：顯著性Go Term分析顯示,這些DNA損傷分泌蛋白主要參與細胞生長、分化、凋亡、侵襲及信號轉(zhuǎn)導等生物學功能；顯著性相關信號通路分析顯示,蛋白芯片篩選出的差異表達蛋白主要通過細胞因子與受體相互作用、ALK1、TGF-β、PI3K/AKT、JAK/STAT等通路發(fā)揮生物學功能。Western blot結果顯示,IDA處理HS-5后的條件培養(yǎng)基可顯著增強AML細胞中P38 MAPK、AKT、ERK和STAT3的磷酸化水平,與軟件預測分析結果一致。8. BMSCs DNA損傷分泌蛋白在AML患者骨髓中的表達：Real-Time RT-PCR結果顯示,Activin、6Ckine、FGF10.、EG-VEGF和GH在初診和治療后AML患者骨髓中的mRNA表達明顯高于正常對照,且在治療后患者骨髓中的mRNA表達明顯高于初診AML患者。9.體外鑒定BMSCs DNA損傷分泌蛋白中參與AML耐藥的關鍵因子：9.1重組人Activin A或Activin A中和抗體對AML細胞增殖和藥物敏感性的影響：CCK8結果顯示,與對照組相比,Activin A組中Kasumi-1細胞的增殖未見顯著改變；與對照組相比,在ADR和IDA作用下,ActivinA組中Kasumi-1細胞的相對存活率亦無明顯改變；在應用IDA和NS處理HS-5后條件培養(yǎng)基以及含有0.5%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1細胞時,與對照組相比,Activin A中和抗體組中THP-1細胞的相對存活率未見顯著改變。9.2重組人EG-VEGF對AML細胞凋亡、增殖和藥物敏感性的影響：流式細胞術和CCK8結果顯示,在不同濃度EG-VEGF作用下,THP-1細胞的凋亡率和增殖未見顯著改變。在ADR和IDA作用下,隨著EG-VEGF濃度的增加,THP-1細胞的相對存活率亦無明顯改變。9.3重組人BTC對AML細胞凋亡、增殖和藥物敏感性的影響：流式細胞術和CCK8結果顯示,隨著BTC濃度的增加,THP-1細胞的凋亡率呈現(xiàn)降低趨勢而增殖速率逐漸增快。與對照組相比,在IDA作用下,隨著BTC濃度的增加,THP-1細胞的相對存活率呈現(xiàn)升高趨勢。9.4重組人FGF10可增強AML細胞對化療藥物IDA的抵抗：CCK8結果顯示,與對照組相比,在IDA作用下,FGF10組中THP-1細胞的相對存活率明顯升高。結論：1.化療可誘導BMSCs和HUVECs發(fā)生DNA損傷,并通過分泌一組DNA損傷蛋白介導AML耐藥。2. BMSCs DNA損傷分泌蛋白可能通過MAPK和STAT3信號通路參與AML耐藥。3.外源性FGF10可降低AML細胞對化療藥物的敏感性,提示FGF10可能是BMSCs DNA損傷介導AML耐藥的關鍵因子。第二部分FGF10/FGFR2信號在BMSCs DNA損傷介導AML耐藥中的作用機制研究研究背景：近年研究提示,腫瘤微環(huán)境賦予了腫瘤抗藥物治療的先天性耐受,靶向腫瘤微環(huán)境已成為腫瘤領域研究的熱點�；�、放療以及其他應激均可誘導腫瘤微環(huán)境中的良性支持細胞發(fā)生DNA損傷并啟動DNA損傷反應,導致大量細胞因子、生長因子和蛋白酶的產(chǎn)生和分泌,從而促進炎癥、腫瘤血管形成、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤細胞增殖并增強腫瘤細胞對化療藥物的抵抗,最終介導腫瘤耐藥。因此,探索腫瘤微環(huán)境基質(zhì)細胞DNA損傷分泌蛋白在腫瘤耐藥中的作用及其上、下游調(diào)控機制可為腫瘤的靶向治療提供新思路。成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)是骨髓造血微環(huán)境的重要組成因子,在造血調(diào)控中發(fā)揮重要作用,并與白血病細胞的增殖、凋亡和耐藥密切相關。FGF10又稱膠質(zhì)細胞生長因子2,是FGF家族成員之一,主要由成纖維細胞和其他間充質(zhì)來源的細胞分泌。成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptors, FGFRs)是FGF的主要作用受體,屬于酪氨酸激酶受體家族,包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4成員,其中FGFR2是FGF10的高親和受體。近年研究表明,FGF10可通過自分泌和旁分泌的方式促進腫瘤細胞增殖,在胰腺癌、乳腺癌、肺癌、皮膚癌和前列腺癌等多種實體瘤的存活中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),FGF10可通過激活下游STAT1/P21、MAPK、PLC-γ和P13K通路促進腫瘤細胞的增殖并抑制其凋亡。另有研究顯示,FGF10通過FGFR2誘導胰腺癌細胞的遷移和侵襲,導致預后不良。以上研究提示,FGF10/FGFR2信號在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用,有望成為克服腫瘤耐藥的一個新靶點。在第一部分研究中,我們應用蛋白芯片技術篩選出44種BMSCs DNA損傷分泌蛋白,并對差異倍數(shù)較高的Activin A、6Ckine、FGF10、BTC、EG-VEGF和GH進行了驗證。同時,我們通過進一步的生物學行為實驗發(fā)現(xiàn),外源性重組人FGF10可降低AML細胞對化療藥物的敏感性,提示FGF10可能是BMSCsDNA損傷介導AML耐藥的關鍵因子。然而,其具體調(diào)控機制目前尚不清楚。研究目的：本課題擬在第一部分研究基礎上進一步探究BMSCs DNA損傷后分泌的FGF10在介導AML耐藥中的具體機制。研究BMSCs DNA損傷后信號通路的改變并對其進行干預以尋找FGF10異常表達的上游調(diào)控機制；明確FGFRs在AML細胞系和AML患者骨髓中的表達以及BMSCs DNA損傷后條件培養(yǎng)基對AML細胞表面FGFRs表達的影響,并探討FGF10對AML細胞表面FGFRs及下游信號通路的影響；應用FGFRs小分子抑制劑和FGFR2下調(diào)病毒探究靶向FGF10/FGFR2信號逆轉(zhuǎn)AML耐藥的可能性。本研究預期將從骨髓微環(huán)境角度闡明FGF10/FGFR2信號在BMSCs DNA損傷介導AML耐藥的分子機制,為AML的靶向治療提供新思路。研究方法：1.研究BMSCs和HUVECs DNA損傷后信號通路的改變：將HS-5和HUVECs分別暴露于化療藥物ADR、IDA和Ara-C以及NS 24小時,Western blot方法檢測NF-κB、P38 MAPK、mTOR和β-catenin信號通路的改變。2.阻斷BMSCs NF-κB信號通路對AML細胞生物學行為和DNA損傷分泌蛋白表達的影響。2.1NF-κB抑制劑處理HS-5細胞：應用NF-κB抑制劑Bay11-7082處理HS-5細胞1小時、3小時和6小時,Western blot方法檢測NF-κB P65、p-P65、IKBa的蛋白表達,驗證抑制劑效果。2.2阻斷BMSCs NF-κB信號通路對AML細胞藥物敏感性和凋亡的影響：分別應用Bay11-7082、Bay 11-7082聯(lián)合ADR處理HS-5后的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)AML細胞,并給予一定濃度的ADR處理72小時,CCK8方法和Annexin V/PI染色后流式細胞術檢測AML細胞相對存活率和凋亡率的改變。2.3阻斷BMSCs NF-κB信號通路對DNA損傷分泌蛋白表達的影響：Bayll-7082處理HS-5細胞6小時后,給予ADR、IDA和Ara-C處理24小時,Real-time RT-PCR方法檢測IL-6、IL-8、Activin A、CYR61、6Ckine、FGF10、EG-VEGF和GH基因的mRNA表達。3. BMSCs DNA損傷后β-catenin通路對FGF10表達的調(diào)控機制研究：將HS-5細胞暴露于不同濃度的β-catenin激活劑(LiCl)24小時,細胞免疫熒光、Westernblot和Real-time RT-PCR方法檢測β-catenin及其下游靶基因(c-Myc、CyclinD1、 CD44、Trib2)和FGF10的表達。4. FGFRs (FGR1、FGFR2、FGFR3)表達水平的檢測。4.1 Real-time RT-PCR方法檢測FGFR1、FGFR2、FGFR3在AML細胞中的mRNA表達。4.2 FGFRs在AML患者和正常對照骨髓中的表達：收集144例AML患者和34例正常對照骨髓標本,采用密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞,Real-time RT-PCR方法檢測FGFR1、FGFR2、FGFR3的mRNA表達。4.3 BMSCs DNA損傷后條件培養(yǎng)基對AML細胞中FGFRs表達的影響：應用IDA和NS處理HS-5后的條件培養(yǎng)基以及RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1細胞24小時,Real-time RT-PCR方法檢測FGFR1和FGFR2的mRNA表達。5.研究FGF10介導AML耐藥的具體機制。5.1重組人FGF10處理AML細胞后FGFR1和FGFR2的表達改變：將THP-1和U937細胞饑餓過夜培養(yǎng)后,加入不同濃度的重組人FGF10處理一定時間,Western blot和Real-Time RT-PCR方法檢測FGFR1、FGFR2和下游活化分子pFRS2a的表達。5.2重組人FGF10處理AML細胞后下游信號通路的改變：FGF10處理THP-1和U937細胞后,Western blot方法檢測P38MAPK、AKT、ERK和STAT3的磷酸化水平。6.探討阻斷AML細胞中FGFR2表達逆轉(zhuǎn)AML耐藥的可能性。6.1阻斷FGFR2表達對AML細胞藥物敏感性的影響：應用FGFRs抑制劑BGJ398和PD173074處理THP-1和U937細胞1小時,并給予一定濃度的ADR、IDA、 Arac處理72小時,CCK8方法檢測AML細胞相對存活率的改變。6.2阻斷FGFR2表達對AML細胞下游信號通路的影響：應用BGJ398和PD173074處理THP-1細胞1小時,Western blot方法檢測FGFR2、下游活化分子pFRS2α以及下游P38MAPK、AKT、ERK和STAT3信號通路的改變。7.下調(diào)AML細胞中FGFR2表達對AML細胞增殖和藥物敏感性的影響。7.1病毒感染：應用FGFR2-ShRNA (ShFGFR2)和Control-ShRNA (ShCtrl)慢病毒感染THP-1細胞72小時,熒光顯微鏡下觀察感染效率,應用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定感染細胞,Western blot和Real-time RT-PCR方法檢測病毒感染穩(wěn)篩后FGFR2的表達,驗證轉(zhuǎn)染效率。7.2 CCK8方法檢測細胞增殖：CCK8方法檢測轉(zhuǎn)染ShFGFR2和ShCtrl慢病毒的THP-1細胞的增殖情況。7.3 CCK8方法檢測細胞藥物敏感性的改變：CCK8方法檢測不同濃度ADR作用下轉(zhuǎn)染ShFGFR2和ShCtrl'慢病毒的THP-1細胞相對存活率的改變。8.阻斷AML細胞FGFR2對抑癌基因PTEN表達的影響：收集PD173074處理后以及轉(zhuǎn)染ShFGFR2和ShCtrl'慢病毒的THP-1細胞,Western blot方法檢測PTEN和pPTEN的蛋白表達。9.統(tǒng)計分析：應用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù),采用Student's t檢驗和非參數(shù)檢驗進行統(tǒng)計分析。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。研究結果：1. BMSCs和HUVECs DNA損傷后信號通路的改變：Western blot結果顯示,與對照組相比,NF-κB P65和P38 MAPK在ADR、IDA或Ara-C處理后的HS-5或HUVECs中的磷酸化水平明顯升高。與對照組相比,β-catenin在ADR、IDA或Ara-C藥物處理后的HS-5胞漿和胞核中的蛋白表達明顯升高,而mTOR的磷酸化水平未見顯著改變。2.阻斷BMSCs NF-κB信號通路對AML細胞生物學行為和DNA損傷分泌蛋白表達的影響：2.1 Bay11-7082對NF-κB信號通路的抑制作用：Western blot結果顯示,HS-5細胞暴露于Bayll-70826小時后,NF-κBP65的磷酸化水平以及IKBa的蛋白表達顯著降低。2.2阻斷BMSCs NF-κB信號通路對AML細胞藥物敏感性和凋亡的影響：(1)CCK8和流式細胞術結果顯示,與DMSO處理HS-5后的條件培養(yǎng)基組相比,Bayll-7082處理HS-5后的條件培養(yǎng)基組中AML細胞的相對存活率明顯降低,而凋亡率未見明顯改變。(2)CCK8和流式細胞術結果顯示,與DMSO聯(lián)合ADR處理HS-5后的條件培養(yǎng)基組相比,Bayll-7082聯(lián)合ADR處理HS-5后的條件培養(yǎng)基組中AML細胞的相對存活率明顯降低,而凋亡率呈現(xiàn)升高趨勢。2.3阻斷BMSCs NF-κB信號通路對DNA損傷分泌蛋白表達的影響：Real-time RT-PCR結果顯示,在化療藥物作用下,與DMSO組相比,IL-6、IL-8和ActivinA在Bayll-7082組中的mRNA表達明顯降低,6Ckine、FGF-10、EG-VEGF和GH在Bayll-7082組中的mRNA表達明顯升高,而CYR61的mRNA表達未見顯著改變。3. BMSCs DNA損傷后通過β-catenin通路調(diào)控FGF10的表達：細胞免疫熒光結果顯示,與對照組相比,β-catenin在LiCl處理組胞核中的蛋白表達顯著升高。Western blot結果顯示,與對照組相比,β-catenin及其下游靶基因c-Myc、 CyclinD1和CD44以及FGF10在LiCl處理組細胞中的蛋白水平明顯升高。Real-time RT-PCR結果顯示,在不同濃度LiCl作用下,HS-5細胞中c-Myc、 CyclinDl的mRNA表達未見顯著改變,而Trib2和FGF10的mRNA表達呈現(xiàn)升高趨勢。4. FGFRs (FGR1、FGFR2、FGFR3)表達水平的檢測：4.1 FGFRs在AML細胞中的表達：Real-time RT-PCR結果顯示,FGFR1、FGFR2和FGFR3在THP-1、U937和Kasumi-1細胞中的mRNA表達相對較高。4.2 FGFRs在AML患者和正常對照骨髓中的表達：Real-time RT-PCR結果顯示,與正常對照相比,FGFR1和FGFR2在治療后AML患者骨髓中的mRNA表達明顯升高。與初診AML患者相比,FGFR3在治療后AML患者骨髓中的mRNA表達明顯升高。4.3 BMSCs DNA損傷后條件培養(yǎng)基對AML細胞中FGFRs表達的影響：Real-time RT-PCR結果顯示,FGFR1和FGFR2在IDA處理HS-5后的條件培養(yǎng)基組中的mRNA表達明顯高于NS處理HS-5后的條件培養(yǎng)基組和RPMI 1640培養(yǎng)基組。5.FGF10通過活化AML細胞FGFR2并激活下游MAPK/STAT3信號通路參與AML耐藥：5.1 FGF10激活AML細胞中FGFR1和FGFR2的蛋白表達：Western blot和Real-Time RT-PCR結果顯示,在不同濃度FGF10作用下,THP-1和U937細胞中FGFR1、FGFR2及下游活化分子pFRS2a的蛋白表達明顯升高,而]mRNA水平無明顯改變。5.2 FGF10激活AML細胞中MAPK/STAT3信號通路：Western blot結果顯示,在FGF10作用下,AML細胞中P38MAPK、AKT、ERK和STAT3的磷酸化水平明顯升高。6.阻斷AML細胞中FGFR2表達通過抑制MAPK/STAT3通路逆轉(zhuǎn)AML耐藥：6.1阻斷FGFR2表達可增強AML細胞對化療藥物的敏感性：CCK8結果顯示,THP-1和U937在BGJ398處理組和PD173074處理組中的相對存活率明顯低于DMSO處理組。6.2阻斷FGFR2表達可抑制下游MAPK/STAT3信號通路：Western blot結果顯示,與DMSO處理組相比,BGJ398處理組中FGFR2和pFRS2a的蛋白表達明顯降低；與DMSO處理組相比,BGJ398處理組中P38 MAPK和AKT的磷酸化水平顯著降低,STAT3的磷酸化水平未見顯著改變。與DMSO處理組相比,PD173074處理組中P38MAPK、EKR和STAT3的磷酸化水平均顯著降低。7.下調(diào)AML細胞中FGFR2表達可逆轉(zhuǎn)AML耐藥：7.1轉(zhuǎn)染效率檢測：Real-time RT-PCR和Western blot結果顯示,與轉(zhuǎn)染ShCtrl的THP-1細胞相比,轉(zhuǎn)染ShFGFR2的THP-1細胞中FGFR2的mRNA和蛋白表達明顯降低。7.2下調(diào)FGFR2表達可抑制AML細胞增殖：CCK8結果顯示,與轉(zhuǎn)染ShCtrl的THP-1細胞相比,轉(zhuǎn)染ShFGFR2的THP-1細胞的增殖速率顯著降低。7.3下調(diào)FGFR2表達可增強AML細胞對化療藥物的敏感性：CCK8結果顯示,在不同濃度ADR作用下,與轉(zhuǎn)染ShCtrl的THP-1細胞相比,轉(zhuǎn)染ShFGFR2的THP-1細胞相對存活率明顯降低。8.阻斷AML細胞FGFR2可激活抑癌基因PTEN的表達:Western blot結果顯示,與DMSO處理組相比,PD173074處理組中PTEN的磷酸化水平顯著升高。與轉(zhuǎn)染ShCtrl的THP-1細胞相比,轉(zhuǎn)染ShFGFR2的THP-1細胞中PTEN的磷酸化水平輕微升高。結論：1. BMSCsDNA損傷后NF-κB和P38 MAPK信號通路顯著活化,其中阻斷NF-κB信號通路可增強AML細胞對化療藥物的敏感性并促進其凋亡,提示NF-κB信號通路在BMSCs DNA損傷介導AML耐藥中發(fā)揮重要作用。2. BMSCs DNA損傷后通過β-catenin通路調(diào)控FGF10的表達,且損傷后BMSCs釋放的FGF10以旁分泌形式通過激活AML細胞FGFR2/MAPK/STAT3信號通路介導AML耐藥。3.阻斷FGFR2表達可通過抑制MAPK/STAT3信號通路逆轉(zhuǎn)AML耐藥,提示靶向AML細胞受體酪氨酸激酶FGFR2/MAPK/STAT3通路有望成為抗AML耐藥治療的新策略。第三部分Th細胞在AML中的異常表達研究背景：近年來,隨著對白血病發(fā)病機制的深入研究,AML患者體內(nèi)免疫功能異常備受廣泛學者關注。目前,免疫界學者普遍認為免疫系統(tǒng)功能紊亂參與AML的發(fā)病,是AML難治復發(fā)和死亡率較高的重要原因之一。T細胞介導的細胞免疫在抗腫瘤免疫與機體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,其中輔助性T細胞(Th)是機體免疫應答的重要調(diào)控者和效應者。研究表明,隨著腫瘤的進展白血病細胞可抑制宿主免疫系統(tǒng),這與Th細胞的功能障礙相關。然而,Th細胞免疫功能紊亂在AML發(fā)病中的具體作用機理尚未完全闡明。Th細胞是一群能夠輔助T、B淋巴細胞應答的功能性T細胞。過去對Th細胞的研究主要限于經(jīng)典的Thl和Th2亞群,關于白血病此類Th亞群的研究已有報道,多數(shù)學者認為AML中Th1/Th2比值降低,推測AML中存在Thl功能低下而Th2功能亢進的免疫失衡狀態(tài)。然而,目前有關AML患者外周血中Th1/Th2和其他新型Th亞群的相互關系仍需進一步研究。Th17細胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一群以分泌白介素17(IL-17)為主的CD4+T細胞,在慢性炎癥、腫瘤和自身免疫性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),Th17細胞及其細胞因子IL-17在初診AML患者外周血中的比例明顯升高,而在完全緩解AML患者中的比例明顯降低。另有研究顯示,與正常對照相比,IL-17在初診AML患者中的水平無明顯改變。由此可見,Th17細胞在AML中的作用尚存有爭議,仍需進一步闡述。Th22細胞是新近發(fā)現(xiàn)的一群分泌IL-22、但不分泌IL-17和IFN-γ的CD4+T細胞,具有獨特的基因表達和功能特性,在炎癥和自身免疫性疾病中同樣發(fā)揮重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn),Th22和IL-22在初診AML患者骨髓中的表達明顯降低,提示Th22及其細胞因子IL-22參與AML的發(fā)生發(fā)展。然而,Th22在AML患者外周血中的作用目前尚未見報道,亟待進一步研究。研究目的：本研究詣在檢測AML患者外周血中Th22、Th17、純Th17和Th1細胞的表達以及外周血上清中IL-22和IL-17的分泌情況,并分析Th細胞與IL-22和IL-17的相關性。研究AML患者外周血中轉(zhuǎn)錄因子RORC的表達,分析其與Th細胞的相關性,明確RORC在AML患者體內(nèi)異常表達的Th細胞分化中的作用。比較分析不同類型AML患者外周血中Th細胞的表達,并評估其與AML疾病活動程度的相關性。研究方法：1.標本采集：收集AML患者外周血標本56例,包括初診組26例,完全緩解組(CR)14例和未完全緩解組(Non-CR)16例。收集正常對照外周血標本30例。采用差速離心法分離外周血血清,密度梯度心法分離外周血單個核細胞(PBMCs)。2.流式細胞術法：流式細胞術檢測AML患者和正常對照外周血中Th22、Th17、純Th17和Th1細胞的比例。3.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法：ELISA方法檢測AML患者和正常對照血清中IL-17和IL-22的分泌情況。4. Real-time RT-PCR方法：Real-time RT-PCR方法檢測AML患者和正常對照PBMCs中RORC基因的mRNA表達。5.統(tǒng)計分析：應用Mann-Whitney U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗比較分析AML患者和正常對照組中Th細胞、IL-17、IL-22、RORC以及不同類型AML患者中Th細胞的表達差異。應用Spearman秩相關分析Th細胞和細胞因子、Th細胞和RORC的表達以及Th細胞和AML患者臨床特征的相關性。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。研究結果：1.Th22細胞和IL-22在AML患者外周血和外周血血清中的表達。1.1流式細胞術結果顯示,與正常對照或CR AML患者相比,Th22細胞在初診和Non-CR AML患者中的比例明顯升高,而Th22細胞在初診和Non-CR AML患者之間的比例無明顯差異。1.2 ELISA結果顯示,與正常對照組相比,IL-22在初診AML患者中的比例明顯升高,IL-22在Non-CR或CR AML患者中的表達無明顯改變。IL-22在初診和Non-CR AML患者之間的表達亦無明顯差異。2.Th17、純Th17細胞和IL-17在AML患者外周血和外周血血清中的表達。(1)流式細胞術結果顯示,與正常對照組相比,Th17細胞在初診、Non-CR和CRAML患者中的水平均明顯升高,而Th17細胞在CR與初診AML患者或CR與Non-CR AML患者之間無明顯差異。(2)流式細胞術結果顯示,與正常對照相比,純Th17細胞在初診和Non-CR AML患者中的水平均明顯升高。然而,純Th17細胞在初診和Non-CR AML患者之間的表達無明顯差異。(3) ELISA結果顯示,與正常對照相比,IL-17在初診、Non-CR和CR AML患者血清中的水平明顯降低。3.Th1細胞在AML患者外周血中的表達：流式細胞術結果顯示,與正常對照相比,Th1細胞在初診AML患者中的比例明顯降低,在其他各組之間未見明顯差異。4.AML患者外周血中Th細胞以及與細胞因子IL-22、IL-17之間的相關分析。(1) Spearman秩相關分析結果顯示,在初診AML患者中,Th22和純Th17細胞呈明顯正相關,Th22和Th1細胞呈明顯負相關,而Th22和Th1細胞無顯著相關性。在Non-CR患者和CR患者中,Th22、Th17、純Th17和Th1細胞之間均無相關性。(2) Spearman秩相關分析結果顯示,在初診AML患者中,血漿IL-22濃度與純Th17細胞呈正相關,而IL-22與Th17、Th1細胞及IL-17無明顯相關性。5. RORC在AML患者PBMCs中的mRNA表達及其與Th細胞的相關分析。(1) Real-time RT-PCR結果顯示,RORC在Non-CR AML患者中的mRNA表達明顯高于初診AML患者或正常對照。與正常對照相比,RORC在CR AML患者中的mRNA表達明顯升高。與之相比,RORC在Non-CR、CR和初診AML患者之間的mRNA表達無明顯差異。(2) Spearman秩相關分析結果顯示,在Non-CR AML患者中,RORC與Th22細胞呈正相關,RORC與純Th17細胞接近正相關。6. Th22、Th17、純Th17及Thl細胞與AML患者臨床特征的相關分析：Spearman秩相關分析結果顯示,在初診AML患者中,Th22細胞與AML患者外周血原始細胞的比例呈顯著正相關,Th1細胞與AML患者外周血原始細胞的比例呈顯著負相關。7.不同類型AML患者中Th22、Th17、純Th17和Th1細胞的表達：流式細胞術結果顯示,Th22、Th17和純Th17細胞在急性粒單核細胞白血病患者中的表達明顯高于急性單核細胞白血病患者。然而,Th1細胞在不同類型AML患者中的表達未見明顯差異。結論：1.AML患者外周血中存在Th22、Th17、純Th17和Th1細胞的異常表達,Th22和純Th17細胞顯著正相關,提示Th22和純Th17可能協(xié)同促進AML發(fā)病。2. Non-CR AML患者中RORC與Th22、純Th17細胞呈正相關,RORC可能參與Non-CR AML患者中Th22和純Th17細胞分化。3.初診AML患者中Th22細胞的高表達與外周血原始細胞的增高顯著正相關,提示Th22可能是評估AML患者危險程度的一個新的生物學指標。4.急性粒單核細胞白血病中存在Th22、Th17和純Th17的異常高表達,Th細胞可能主要參與急性粒單核細胞白血病的發(fā)生發(fā)展。
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圖１．細胞免疫巧光方法檢測Ｙ－Ｈ２ＡＸ在化療藥物處理后的ＨＳ－５細胞中的表達逡逑

ＮＳ邐ＡＤＲ邐ＩＤＡ邐Ａｒａ－Ｃ逡逑Ｙ－Ｈ２ＡＸ－ＴＲＩＴＣ逡逑。？國WW■逡逑Ｍ。？國WW國逡逑ＨＳ－５逡逑圖１．細胞免疫巧光方法檢測Ｙ－Ｈ２ＡＸ在化療藥物處理后的ＨＳ－５細胞中的表達逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.71
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本文編號：2534905