【摘要】：第一部分BMSCs DNA損傷分泌蛋白的篩選及在AML耐藥中的作用鑒定研究背景：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一組遺傳學(xué)異常、治療反應(yīng)和預(yù)后均有極大差異的造血系統(tǒng)惡性疾患,嚴(yán)重威害人類健康。迄今為止,以蒽環(huán)類和阿糖胞苷為主的聯(lián)合化療、新型靶向制劑以及造血干細(xì)胞移植雖較大程度改善了AML患者的生存,但仍有大部分患者因多藥耐藥而導(dǎo)致復(fù)發(fā)和死亡,臨床預(yù)后極差。因此,深入探究AML耐藥的發(fā)生機(jī)制及其逆轉(zhuǎn)對策對于提高AML患者療效、減少復(fù)發(fā)和改善預(yù)后具有重大臨床意義。近年研究表明,骨髓微環(huán)境與白血病細(xì)胞相互作用在白血病多藥耐藥和復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用。骨髓微環(huán)境主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)、細(xì)胞外基質(zhì)及各種可溶性因子構(gòu)成,其中BMSCs是參與白血病細(xì)胞生存和耐藥的最重要因素。研究報道,BMSCs可通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Caspase-3,使HL60和HL60/VCR細(xì)胞對拓?fù)涮婵?TPT)的藥物敏感性下降。另有研究發(fā)現(xiàn),骨髓內(nèi)皮細(xì)胞可促進(jìn)AML細(xì)胞增殖,并抑制化療藥物誘導(dǎo)的AML細(xì)胞凋亡。我們前期研究發(fā)現(xiàn),AML細(xì)胞可通過直接接觸的方式影響骨髓內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和小管形成,從而參與白血病細(xì)胞耐藥。由此可見,BMSCs可通過多種機(jī)制促進(jìn)白血病細(xì)胞耐藥,靶向BMSCs可能會成為克服AML耐藥的有力手段。最新研究提示,化療藥物在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生DNA損傷并導(dǎo)致其死亡或衰老的同時,也可誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生DNA損傷,啟動DNA損傷反應(yīng),并激活下游細(xì)胞因子的產(chǎn)生和分泌,這些細(xì)胞因子在介導(dǎo)腫瘤獲得性耐藥中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),前列腺癌成纖維細(xì)胞經(jīng)化療處理后發(fā)生明顯的DNA損傷并分泌一組表達(dá)明顯升高的蛋白,其中WNT16B通過活化經(jīng)典Wnt信號通路促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖和耐藥。另有研究顯示,阿霉素治療淋巴瘤小鼠后,可誘導(dǎo)小鼠胸腺內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生DNA損傷并分泌一類影響淋巴瘤細(xì)胞生存的細(xì)胞因子,如IL-6和TIMP-1。還有研究報道,乳腺癌內(nèi)皮細(xì)胞和其它基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)化療損傷后分泌TNF-α, TNF-α通過活化NF-κB信號通路并提高CXCL1/2的表達(dá),最終導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性下降。近期研究表明,化療藥物在殺傷白血病細(xì)胞的同時,也可損傷骨髓微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞。然而,BMSCs DNA損傷后會釋放哪些分泌型蛋白,這些分泌型蛋白又是通過何種機(jī)制介導(dǎo)白血病細(xì)胞耐藥,目前均尚不明確,亟待進(jìn)一步研究。研究目的：本課題擬研究化療藥物對BMSCs和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs) DNA損傷的影響,并明確其分泌的條件培養(yǎng)基在AML耐藥中的作用；篩選和驗證BMSCsDNA損傷后條件培養(yǎng)基中的差異表達(dá)蛋白,并對其生物學(xué)功能和信號通路進(jìn)行軟件預(yù)測分析；體外鑒定BMSCs DNA損傷分泌蛋白中參與AML耐藥的關(guān)鍵因子,并研究其在AML患者骨髓中的表達(dá)。預(yù)期揭示骨髓微環(huán)境介導(dǎo)AML耐藥的新機(jī)制,對克服AML耐藥、清除微小殘留病變具有重要意義。研究方法：1.化療藥物對BMSCs和HUVECs DNA損傷的影響：將骨髓基質(zhì)細(xì)胞系HS-5和HUVECs分別暴露于化療藥物阿霉素(ADR)、去甲氧柔紅霉素(IDA)和阿糖胞苷(Ara-C)以及生理鹽水(NS)24小時,細(xì)胞免疫熒光和Western blot方法檢測DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX和PARP1的表達(dá)。2. BMSCs和HUVECs DNA損傷后條件培養(yǎng)基對AML細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。2.1 HS-5和HUVECs DNA損傷后條件培養(yǎng)基對AML細(xì)胞藥物敏感性的影響：應(yīng)用ADR、IDA和NS處理HS-5和HUVECs后的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)AML細(xì)胞,以含有0.5% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基為對照,每組分別加入不同濃度梯度的ADR和IDA,培養(yǎng)72小時后,CCK8方法檢測AML細(xì)胞相對存活率的改變。2.2HS-5 DNA損傷后條件培養(yǎng)基對AML細(xì)胞增殖的影響：應(yīng)用ADR和NS處理HS-5后的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1和NB4細(xì)胞,以含有0.5% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基為對照,CCK8方法檢測細(xì)胞增殖并繪制生長曲線。3.HS-5與AML細(xì)胞直接共培養(yǎng)對AML細(xì)胞凋亡的影響：將HS-5與Kasumi-1細(xì)胞以不同比例直接共培養(yǎng),并給予ADR處理48小時,AnnexinV/PI雙染后流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的改變。4.IL-6、IL-8和CYR61在DNA損傷后BMSCs中的表達(dá)：ELISA方法檢測HS-5和原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)損傷前后的條件培養(yǎng)基中IL-6、IL-8和CYR61的蛋白表達(dá)；Real-Time RT-PCR方法檢測IL-6、IL-8和CYR61在ADR、IDA和(或)Ara-C處理后的HS-5和MSCs中的mRNA表達(dá)。5.篩選BMSCs DNA損傷后條件培養(yǎng)基中的差異表達(dá)蛋白：收集ADR和NS處理HS-5后的條件培養(yǎng)基,應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)檢測HS-5 DNA損傷前后條件培養(yǎng)基中分泌蛋白的表達(dá)情況,選取差異倍數(shù)較高的蛋白作為候選因子。6.驗證蛋白芯片結(jié)果：Real-time RT-PCR方法檢測ADR、IDA、Ara-C和NS處理后的HS-5中候選因子的mRNA表達(dá)。7.蛋白芯片結(jié)果的生物學(xué)功能和信號通路預(yù)測分析及驗證：應(yīng)用相關(guān)軟件對蛋白芯片結(jié)果進(jìn)行Go Term和顯著性相關(guān)信號通路分析。應(yīng)用IDA和NS處理HS-5后的條件培養(yǎng)基以及含有0.5% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1和U937細(xì)胞6小時,Western blot方法對信號通路的預(yù)測分析結(jié)果進(jìn)行驗證。8.候選BMSCs DNA損傷分泌蛋白在AML患者骨髓中的表達(dá)：收集144例AML患者和34例正常對照骨髓標(biāo)本,應(yīng)用密度梯度心法分離骨髓單個核細(xì)胞,Real-time RT-PCR方法檢測候選蛋白的mRNA:表達(dá)。9.體外鑒定BMSCs DNA損傷分泌蛋白中參與AML耐藥的關(guān)鍵因子：將AML細(xì)胞饑餓過夜培養(yǎng)后,在培養(yǎng)基中加入不同濃度的候選蛋白或中和抗體,流式細(xì)胞術(shù)和CCK8方法檢測候選蛋白對AML細(xì)胞凋亡、增殖或藥物敏感性的影響。研究結(jié)果：1.證實(shí)化療藥物可誘導(dǎo)BMSCs和HUVECs DNA損傷：細(xì)胞免疫熒光和Western blot結(jié)果顯示,與對照組(NS處理組)相比,γ-H2AX、PARP1在ADR、IDA或Ara-C藥物處理后HS-5或HUVECs中的蛋白表達(dá)明顯升高。2. BMSCs和HUVECs DNA損傷后條件培養(yǎng)基對AML細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：2.1條件培養(yǎng)基對AML藥物敏感性的影響：CCK8結(jié)果顯示,在不同濃度ADR和IDA作用下,HS-5和]HUVECs DNA損傷后條件培養(yǎng)基組中AML細(xì)胞的相對存活率明顯高于未損傷組和RPMI 1640組。2.2條件培養(yǎng)基對AML細(xì)胞增殖的影響：CCK8結(jié)果顯示,ADR處理HS-5后的條件培養(yǎng)基對AML細(xì)胞的增殖無顯著影響。3.HS-5與AML細(xì)胞直接共培養(yǎng)對AML細(xì)胞凋亡的影響：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,HS-5與Kasumi-1細(xì)胞直接共培養(yǎng)可顯著降低ADR誘導(dǎo)的Kasumi-1細(xì)胞凋亡。4. IL-6、IL-8HCYR61在DNA損傷后BMSCs中的蛋白和mRNA表達(dá)：4.1ELISA結(jié)果顯示,與對照組相比,IL-6、IL-8和CYR61在ADR處理HS-5后條件培養(yǎng)基以及ADR和IDA處理MSCs后條件培養(yǎng)基中的蛋白水平未見明顯升高。4.2 Real-time RT-PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,IL-6和IL-8在ADR和(或)IDA處理后的HS-5中的mRNA表達(dá)明顯升高,而CYR61的mRNA表達(dá)無明顯改變；與對照組相比,IL-6、IL-8和CYR61在ADR、IDA和Ara-C處理后的MSCs中的mRNA均無顯著改變。5.蛋白芯片篩選結(jié)果：應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)在ADR處理HS-5后的條件培養(yǎng)基中篩選出44個表達(dá)顯著升高的分泌蛋白,其中差異較大的細(xì)胞因子為Activin A= 6Ckine、FGF-10、Betacellulin(BTC)、EG-VEGF和growth hormone (GH),作為候選因子。6.蛋白芯片結(jié)果的驗證：Real-time RT-PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,Activin A、 6Ckine、FGF-10、BTC、EG-VEGF和GH在化療藥物處理后的HS-5中的mRNA表達(dá)明顯升高,與芯片結(jié)果一致。7.蛋白芯片結(jié)果的生物學(xué)功能和信號通路分析及驗證：顯著性Go Term分析顯示,這些DNA損傷分泌蛋白主要參與細(xì)胞生長、分化、凋亡、侵襲及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)功能；顯著性相關(guān)信號通路分析顯示,蛋白芯片篩選出的差異表達(dá)蛋白主要通過細(xì)胞因子與受體相互作用、ALK1、TGF-β、PI3K/AKT、JAK/STAT等通路發(fā)揮生物學(xué)功能。Western blot結(jié)果顯示,IDA處理HS-5后的條件培養(yǎng)基可顯著增強(qiáng)AML細(xì)胞中P38 MAPK、AKT、ERK和STAT3的磷酸化水平,與軟件預(yù)測分析結(jié)果一致。8. BMSCs DNA損傷分泌蛋白在AML患者骨髓中的表達(dá)：Real-Time RT-PCR結(jié)果顯示,Activin、6Ckine、FGF10.、EG-VEGF和GH在初診和治療后AML患者骨髓中的mRNA表達(dá)明顯高于正常對照,且在治療后患者骨髓中的mRNA表達(dá)明顯高于初診AML患者。9.體外鑒定BMSCs DNA損傷分泌蛋白中參與AML耐藥的關(guān)鍵因子：9.1重組人Activin A或Activin A中和抗體對AML細(xì)胞增殖和藥物敏感性的影響：CCK8結(jié)果顯示,與對照組相比,Activin A組中Kasumi-1細(xì)胞的增殖未見顯著改變；與對照組相比,在ADR和IDA作用下,ActivinA組中Kasumi-1細(xì)胞的相對存活率亦無明顯改變；在應(yīng)用IDA和NS處理HS-5后條件培養(yǎng)基以及含有0.5%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1細(xì)胞時,與對照組相比,Activin A中和抗體組中THP-1細(xì)胞的相對存活率未見顯著改變。9.2重組人EG-VEGF對AML細(xì)胞凋亡、增殖和藥物敏感性的影響：流式細(xì)胞術(shù)和CCK8結(jié)果顯示,在不同濃度EG-VEGF作用下,THP-1細(xì)胞的凋亡率和增殖未見顯著改變。在ADR和IDA作用下,隨著EG-VEGF濃度的增加,THP-1細(xì)胞的相對存活率亦無明顯改變。9.3重組人BTC對AML細(xì)胞凋亡、增殖和藥物敏感性的影響：流式細(xì)胞術(shù)和CCK8結(jié)果顯示,隨著BTC濃度的增加,THP-1細(xì)胞的凋亡率呈現(xiàn)降低趨勢而增殖速率逐漸增快。與對照組相比,在IDA作用下,隨著BTC濃度的增加,THP-1細(xì)胞的相對存活率呈現(xiàn)升高趨勢。9.4重組人FGF10可增強(qiáng)AML細(xì)胞對化療藥物IDA的抵抗：CCK8結(jié)果顯示,與對照組相比,在IDA作用下,FGF10組中THP-1細(xì)胞的相對存活率明顯升高。結(jié)論：1.化療可誘導(dǎo)BMSCs和HUVECs發(fā)生DNA損傷,并通過分泌一組DNA損傷蛋白介導(dǎo)AML耐藥。2. BMSCs DNA損傷分泌蛋白可能通過MAPK和STAT3信號通路參與AML耐藥。3.外源性FGF10可降低AML細(xì)胞對化療藥物的敏感性,提示FGF10可能是BMSCs DNA損傷介導(dǎo)AML耐藥的關(guān)鍵因子。第二部分FGF10/FGFR2信號在BMSCs DNA損傷介導(dǎo)AML耐藥中的作用機(jī)制研究研究背景：近年研究提示,腫瘤微環(huán)境賦予了腫瘤抗藥物治療的先天性耐受,靶向腫瘤微環(huán)境已成為腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。化療、放療以及其他應(yīng)激均可誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的良性支持細(xì)胞發(fā)生DNA損傷并啟動DNA損傷反應(yīng),導(dǎo)致大量細(xì)胞因子、生長因子和蛋白酶的產(chǎn)生和分泌,從而促進(jìn)炎癥、腫瘤血管形成、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤細(xì)胞增殖并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的抵抗,最終介導(dǎo)腫瘤耐藥。因此,探索腫瘤微環(huán)境基質(zhì)細(xì)胞DNA損傷分泌蛋白在腫瘤耐藥中的作用及其上、下游調(diào)控機(jī)制可為腫瘤的靶向治療提供新思路。成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)是骨髓造血微環(huán)境的重要組成因子,在造血調(diào)控中發(fā)揮重要作用,并與白血病細(xì)胞的增殖、凋亡和耐藥密切相關(guān)。FGF10又稱膠質(zhì)細(xì)胞生長因子2,是FGF家族成員之一,主要由成纖維細(xì)胞和其他間充質(zhì)來源的細(xì)胞分泌。成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptors, FGFRs)是FGF的主要作用受體,屬于酪氨酸激酶受體家族,包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4成員,其中FGFR2是FGF10的高親和受體。近年研究表明,FGF10可通過自分泌和旁分泌的方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,在胰腺癌、乳腺癌、肺癌、皮膚癌和前列腺癌等多種實(shí)體瘤的存活中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),FGF10可通過激活下游STAT1/P21、MAPK、PLC-γ和P13K通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡。另有研究顯示,FGF10通過FGFR2誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲,導(dǎo)致預(yù)后不良。以上研究提示,FGF10/FGFR2信號在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用,有望成為克服腫瘤耐藥的一個新靶點(diǎn)。在第一部分研究中,我們應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)篩選出44種BMSCs DNA損傷分泌蛋白,并對差異倍數(shù)較高的Activin A、6Ckine、FGF10、BTC、EG-VEGF和GH進(jìn)行了驗證。同時,我們通過進(jìn)一步的生物學(xué)行為實(shí)驗發(fā)現(xiàn),外源性重組人FGF10可降低AML細(xì)胞對化療藥物的敏感性,提示FGF10可能是BMSCsDNA損傷介導(dǎo)AML耐藥的關(guān)鍵因子。然而,其具體調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。研究目的：本課題擬在第一部分研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究BMSCs DNA損傷后分泌的FGF10在介導(dǎo)AML耐藥中的具體機(jī)制。研究BMSCs DNA損傷后信號通路的改變并對其進(jìn)行干預(yù)以尋找FGF10異常表達(dá)的上游調(diào)控機(jī)制；明確FGFRs在AML細(xì)胞系和AML患者骨髓中的表達(dá)以及BMSCs DNA損傷后條件培養(yǎng)基對AML細(xì)胞表面FGFRs表達(dá)的影響,并探討FGF10對AML細(xì)胞表面FGFRs及下游信號通路的影響；應(yīng)用FGFRs小分子抑制劑和FGFR2下調(diào)病毒探究靶向FGF10/FGFR2信號逆轉(zhuǎn)AML耐藥的可能性。本研究預(yù)期將從骨髓微環(huán)境角度闡明FGF10/FGFR2信號在BMSCs DNA損傷介導(dǎo)AML耐藥的分子機(jī)制,為AML的靶向治療提供新思路。研究方法：1.研究BMSCs和HUVECs DNA損傷后信號通路的改變：將HS-5和HUVECs分別暴露于化療藥物ADR、IDA和Ara-C以及NS 24小時,Western blot方法檢測NF-κB、P38 MAPK、mTOR和β-catenin信號通路的改變。2.阻斷BMSCs NF-κB信號通路對AML細(xì)胞生物學(xué)行為和DNA損傷分泌蛋白表達(dá)的影響。2.1NF-κB抑制劑處理HS-5細(xì)胞：應(yīng)用NF-κB抑制劑Bay11-7082處理HS-5細(xì)胞1小時、3小時和6小時,Western blot方法檢測NF-κB P65、p-P65、IKBa的蛋白表達(dá),驗證抑制劑效果。2.2阻斷BMSCs NF-κB信號通路對AML細(xì)胞藥物敏感性和凋亡的影響：分別應(yīng)用Bay11-7082、Bay 11-7082聯(lián)合ADR處理HS-5后的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)AML細(xì)胞,并給予一定濃度的ADR處理72小時,CCK8方法和Annexin V/PI染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測AML細(xì)胞相對存活率和凋亡率的改變。2.3阻斷BMSCs NF-κB信號通路對DNA損傷分泌蛋白表達(dá)的影響：Bayll-7082處理HS-5細(xì)胞6小時后,給予ADR、IDA和Ara-C處理24小時,Real-time RT-PCR方法檢測IL-6、IL-8、Activin A、CYR61、6Ckine、FGF10、EG-VEGF和GH基因的mRNA表達(dá)。3. BMSCs DNA損傷后β-catenin通路對FGF10表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究：將HS-5細(xì)胞暴露于不同濃度的β-catenin激活劑(LiCl)24小時,細(xì)胞免疫熒光、Westernblot和Real-time RT-PCR方法檢測β-catenin及其下游靶基因(c-Myc、CyclinD1、 CD44、Trib2)和FGF10的表達(dá)。4. FGFRs (FGR1、FGFR2、FGFR3)表達(dá)水平的檢測。4.1 Real-time RT-PCR方法檢測FGFR1、FGFR2、FGFR3在AML細(xì)胞中的mRNA表達(dá)。4.2 FGFRs在AML患者和正常對照骨髓中的表達(dá)：收集144例AML患者和34例正常對照骨髓標(biāo)本,采用密度梯度離心法分離骨髓單個核細(xì)胞,Real-time RT-PCR方法檢測FGFR1、FGFR2、FGFR3的mRNA表達(dá)。4.3 BMSCs DNA損傷后條件培養(yǎng)基對AML細(xì)胞中FGFRs表達(dá)的影響：應(yīng)用IDA和NS處理HS-5后的條件培養(yǎng)基以及RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1細(xì)胞24小時,Real-time RT-PCR方法檢測FGFR1和FGFR2的mRNA表達(dá)。5.研究FGF10介導(dǎo)AML耐藥的具體機(jī)制。5.1重組人FGF10處理AML細(xì)胞后FGFR1和FGFR2的表達(dá)改變：將THP-1和U937細(xì)胞饑餓過夜培養(yǎng)后,加入不同濃度的重組人FGF10處理一定時間,Western blot和Real-Time RT-PCR方法檢測FGFR1、FGFR2和下游活化分子pFRS2a的表達(dá)。5.2重組人FGF10處理AML細(xì)胞后下游信號通路的改變：FGF10處理THP-1和U937細(xì)胞后,Western blot方法檢測P38MAPK、AKT、ERK和STAT3的磷酸化水平。6.探討阻斷AML細(xì)胞中FGFR2表達(dá)逆轉(zhuǎn)AML耐藥的可能性。6.1阻斷FGFR2表達(dá)對AML細(xì)胞藥物敏感性的影響：應(yīng)用FGFRs抑制劑BGJ398和PD173074處理THP-1和U937細(xì)胞1小時,并給予一定濃度的ADR、IDA、 Arac處理72小時,CCK8方法檢測AML細(xì)胞相對存活率的改變。6.2阻斷FGFR2表達(dá)對AML細(xì)胞下游信號通路的影響：應(yīng)用BGJ398和PD173074處理THP-1細(xì)胞1小時,Western blot方法檢測FGFR2、下游活化分子pFRS2α以及下游P38MAPK、AKT、ERK和STAT3信號通路的改變。7.下調(diào)AML細(xì)胞中FGFR2表達(dá)對AML細(xì)胞增殖和藥物敏感性的影響。7.1病毒感染：應(yīng)用FGFR2-ShRNA (ShFGFR2)和Control-ShRNA (ShCtrl)慢病毒感染THP-1細(xì)胞72小時,熒光顯微鏡下觀察感染效率,應(yīng)用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定感染細(xì)胞,Western blot和Real-time RT-PCR方法檢測病毒感染穩(wěn)篩后FGFR2的表達(dá),驗證轉(zhuǎn)染效率。7.2 CCK8方法檢測細(xì)胞增殖：CCK8方法檢測轉(zhuǎn)染ShFGFR2和ShCtrl慢病毒的THP-1細(xì)胞的增殖情況。7.3 CCK8方法檢測細(xì)胞藥物敏感性的改變：CCK8方法檢測不同濃度ADR作用下轉(zhuǎn)染ShFGFR2和ShCtrl'慢病毒的THP-1細(xì)胞相對存活率的改變。8.阻斷AML細(xì)胞FGFR2對抑癌基因PTEN表達(dá)的影響：收集PD173074處理后以及轉(zhuǎn)染ShFGFR2和ShCtrl'慢病毒的THP-1細(xì)胞,Western blot方法檢測PTEN和pPTEN的蛋白表達(dá)。9.統(tǒng)計分析：應(yīng)用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù),采用Student's t檢驗和非參數(shù)檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果：1. BMSCs和HUVECs DNA損傷后信號通路的改變：Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,NF-κB P65和P38 MAPK在ADR、IDA或Ara-C處理后的HS-5或HUVECs中的磷酸化水平明顯升高。與對照組相比,β-catenin在ADR、IDA或Ara-C藥物處理后的HS-5胞漿和胞核中的蛋白表達(dá)明顯升高,而mTOR的磷酸化水平未見顯著改變。2.阻斷BMSCs NF-κB信號通路對AML細(xì)胞生物學(xué)行為和DNA損傷分泌蛋白表達(dá)的影響：2.1 Bay11-7082對NF-κB信號通路的抑制作用：Western blot結(jié)果顯示,HS-5細(xì)胞暴露于Bayll-70826小時后,NF-κBP65的磷酸化水平以及IKBa的蛋白表達(dá)顯著降低。2.2阻斷BMSCs NF-κB信號通路對AML細(xì)胞藥物敏感性和凋亡的影響：(1)CCK8和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與DMSO處理HS-5后的條件培養(yǎng)基組相比,Bayll-7082處理HS-5后的條件培養(yǎng)基組中AML細(xì)胞的相對存活率明顯降低,而凋亡率未見明顯改變。(2)CCK8和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與DMSO聯(lián)合ADR處理HS-5后的條件培養(yǎng)基組相比,Bayll-7082聯(lián)合ADR處理HS-5后的條件培養(yǎng)基組中AML細(xì)胞的相對存活率明顯降低,而凋亡率呈現(xiàn)升高趨勢。2.3阻斷BMSCs NF-κB信號通路對DNA損傷分泌蛋白表達(dá)的影響：Real-time RT-PCR結(jié)果顯示,在化療藥物作用下,與DMSO組相比,IL-6、IL-8和ActivinA在Bayll-7082組中的mRNA表達(dá)明顯降低,6Ckine、FGF-10、EG-VEGF和GH在Bayll-7082組中的mRNA表達(dá)明顯升高,而CYR61的mRNA表達(dá)未見顯著改變。3. BMSCs DNA損傷后通過β-catenin通路調(diào)控FGF10的表達(dá)：細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,與對照組相比,β-catenin在LiCl處理組胞核中的蛋白表達(dá)顯著升高。Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,β-catenin及其下游靶基因c-Myc、 CyclinD1和CD44以及FGF10在LiCl處理組細(xì)胞中的蛋白水平明顯升高。Real-time RT-PCR結(jié)果顯示,在不同濃度LiCl作用下,HS-5細(xì)胞中c-Myc、 CyclinDl的mRNA表達(dá)未見顯著改變,而Trib2和FGF10的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)升高趨勢。4. FGFRs (FGR1、FGFR2、FGFR3)表達(dá)水平的檢測：4.1 FGFRs在AML細(xì)胞中的表達(dá)：Real-time RT-PCR結(jié)果顯示,FGFR1、FGFR2和FGFR3在THP-1、U937和Kasumi-1細(xì)胞中的mRNA表達(dá)相對較高。4.2 FGFRs在AML患者和正常對照骨髓中的表達(dá)：Real-time RT-PCR結(jié)果顯示,與正常對照相比,FGFR1和FGFR2在治療后AML患者骨髓中的mRNA表達(dá)明顯升高。與初診AML患者相比,FGFR3在治療后AML患者骨髓中的mRNA表達(dá)明顯升高。4.3 BMSCs DNA損傷后條件培養(yǎng)基對AML細(xì)胞中FGFRs表達(dá)的影響：Real-time RT-PCR結(jié)果顯示,FGFR1和FGFR2在IDA處理HS-5后的條件培養(yǎng)基組中的mRNA表達(dá)明顯高于NS處理HS-5后的條件培養(yǎng)基組和RPMI 1640培養(yǎng)基組。5.FGF10通過活化AML細(xì)胞FGFR2并激活下游MAPK/STAT3信號通路參與AML耐藥：5.1 FGF10激活A(yù)ML細(xì)胞中FGFR1和FGFR2的蛋白表達(dá)：Western blot和Real-Time RT-PCR結(jié)果顯示,在不同濃度FGF10作用下,THP-1和U937細(xì)胞中FGFR1、FGFR2及下游活化分子pFRS2a的蛋白表達(dá)明顯升高,而]mRNA水平無明顯改變。5.2 FGF10激活A(yù)ML細(xì)胞中MAPK/STAT3信號通路：Western blot結(jié)果顯示,在FGF10作用下,AML細(xì)胞中P38MAPK、AKT、ERK和STAT3的磷酸化水平明顯升高。6.阻斷AML細(xì)胞中FGFR2表達(dá)通過抑制MAPK/STAT3通路逆轉(zhuǎn)AML耐藥：6.1阻斷FGFR2表達(dá)可增強(qiáng)AML細(xì)胞對化療藥物的敏感性：CCK8結(jié)果顯示,THP-1和U937在BGJ398處理組和PD173074處理組中的相對存活率明顯低于DMSO處理組。6.2阻斷FGFR2表達(dá)可抑制下游MAPK/STAT3信號通路：Western blot結(jié)果顯示,與DMSO處理組相比,BGJ398處理組中FGFR2和pFRS2a的蛋白表達(dá)明顯降低；與DMSO處理組相比,BGJ398處理組中P38 MAPK和AKT的磷酸化水平顯著降低,STAT3的磷酸化水平未見顯著改變。與DMSO處理組相比,PD173074處理組中P38MAPK、EKR和STAT3的磷酸化水平均顯著降低。7.下調(diào)AML細(xì)胞中FGFR2表達(dá)可逆轉(zhuǎn)AML耐藥：7.1轉(zhuǎn)染效率檢測：Real-time RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染ShCtrl的THP-1細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染ShFGFR2的THP-1細(xì)胞中FGFR2的mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低。7.2下調(diào)FGFR2表達(dá)可抑制AML細(xì)胞增殖：CCK8結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染ShCtrl的THP-1細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染ShFGFR2的THP-1細(xì)胞的增殖速率顯著降低。7.3下調(diào)FGFR2表達(dá)可增強(qiáng)AML細(xì)胞對化療藥物的敏感性：CCK8結(jié)果顯示,在不同濃度ADR作用下,與轉(zhuǎn)染ShCtrl的THP-1細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染ShFGFR2的THP-1細(xì)胞相對存活率明顯降低。8.阻斷AML細(xì)胞FGFR2可激活抑癌基因PTEN的表達(dá):Western blot結(jié)果顯示,與DMSO處理組相比,PD173074處理組中PTEN的磷酸化水平顯著升高。與轉(zhuǎn)染ShCtrl的THP-1細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染ShFGFR2的THP-1細(xì)胞中PTEN的磷酸化水平輕微升高。結(jié)論：1. BMSCsDNA損傷后NF-κB和P38 MAPK信號通路顯著活化,其中阻斷NF-κB信號通路可增強(qiáng)AML細(xì)胞對化療藥物的敏感性并促進(jìn)其凋亡,提示NF-κB信號通路在BMSCs DNA損傷介導(dǎo)AML耐藥中發(fā)揮重要作用。2. BMSCs DNA損傷后通過β-catenin通路調(diào)控FGF10的表達(dá),且損傷后BMSCs釋放的FGF10以旁分泌形式通過激活A(yù)ML細(xì)胞FGFR2/MAPK/STAT3信號通路介導(dǎo)AML耐藥。3.阻斷FGFR2表達(dá)可通過抑制MAPK/STAT3信號通路逆轉(zhuǎn)AML耐藥,提示靶向AML細(xì)胞受體酪氨酸激酶FGFR2/MAPK/STAT3通路有望成為抗AML耐藥治療的新策略。第三部分Th細(xì)胞在AML中的異常表達(dá)研究背景：近年來,隨著對白血病發(fā)病機(jī)制的深入研究,AML患者體內(nèi)免疫功能異常備受廣泛學(xué)者關(guān)注。目前,免疫界學(xué)者普遍認(rèn)為免疫系統(tǒng)功能紊亂參與AML的發(fā)病,是AML難治復(fù)發(fā)和死亡率較高的重要原因之一。T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在抗腫瘤免疫與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,其中輔助性T細(xì)胞(Th)是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要調(diào)控者和效應(yīng)者。研究表明,隨著腫瘤的進(jìn)展白血病細(xì)胞可抑制宿主免疫系統(tǒng),這與Th細(xì)胞的功能障礙相關(guān)。然而,Th細(xì)胞免疫功能紊亂在AML發(fā)病中的具體作用機(jī)理尚未完全闡明。Th細(xì)胞是一群能夠輔助T、B淋巴細(xì)胞應(yīng)答的功能性T細(xì)胞。過去對Th細(xì)胞的研究主要限于經(jīng)典的Thl和Th2亞群,關(guān)于白血病此類Th亞群的研究已有報道,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為AML中Th1/Th2比值降低,推測AML中存在Thl功能低下而Th2功能亢進(jìn)的免疫失衡狀態(tài)。然而,目前有關(guān)AML患者外周血中Th1/Th2和其他新型Th亞群的相互關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。Th17細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一群以分泌白介素17(IL-17)為主的CD4+T細(xì)胞,在慢性炎癥、腫瘤和自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-17在初診AML患者外周血中的比例明顯升高,而在完全緩解AML患者中的比例明顯降低。另有研究顯示,與正常對照相比,IL-17在初診AML患者中的水平無明顯改變。由此可見,Th17細(xì)胞在AML中的作用尚存有爭議,仍需進(jìn)一步闡述。Th22細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的一群分泌IL-22、但不分泌IL-17和IFN-γ的CD4+T細(xì)胞,具有獨(dú)特的基因表達(dá)和功能特性,在炎癥和自身免疫性疾病中同樣發(fā)揮重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn),Th22和IL-22在初診AML患者骨髓中的表達(dá)明顯降低,提示Th22及其細(xì)胞因子IL-22參與AML的發(fā)生發(fā)展。然而,Th22在AML患者外周血中的作用目前尚未見報道,亟待進(jìn)一步研究。研究目的：本研究詣在檢測AML患者外周血中Th22、Th17、純Th17和Th1細(xì)胞的表達(dá)以及外周血上清中IL-22和IL-17的分泌情況,并分析Th細(xì)胞與IL-22和IL-17的相關(guān)性。研究AML患者外周血中轉(zhuǎn)錄因子RORC的表達(dá),分析其與Th細(xì)胞的相關(guān)性,明確RORC在AML患者體內(nèi)異常表達(dá)的Th細(xì)胞分化中的作用。比較分析不同類型AML患者外周血中Th細(xì)胞的表達(dá),并評估其與AML疾病活動程度的相關(guān)性。研究方法：1.標(biāo)本采集：收集AML患者外周血標(biāo)本56例,包括初診組26例,完全緩解組(CR)14例和未完全緩解組(Non-CR)16例。收集正常對照外周血標(biāo)本30例。采用差速離心法分離外周血血清,密度梯度心法分離外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)。2.流式細(xì)胞術(shù)法：流式細(xì)胞術(shù)檢測AML患者和正常對照外周血中Th22、Th17、純Th17和Th1細(xì)胞的比例。3.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法：ELISA方法檢測AML患者和正常對照血清中IL-17和IL-22的分泌情況。4. Real-time RT-PCR方法：Real-time RT-PCR方法檢測AML患者和正常對照PBMCs中RORC基因的mRNA表達(dá)。5.統(tǒng)計分析：應(yīng)用Mann-Whitney U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗比較分析AML患者和正常對照組中Th細(xì)胞、IL-17、IL-22、RORC以及不同類型AML患者中Th細(xì)胞的表達(dá)差異。應(yīng)用Spearman秩相關(guān)分析Th細(xì)胞和細(xì)胞因子、Th細(xì)胞和RORC的表達(dá)以及Th細(xì)胞和AML患者臨床特征的相關(guān)性。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果：1.Th22細(xì)胞和IL-22在AML患者外周血和外周血血清中的表達(dá)。1.1流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與正常對照或CR AML患者相比,Th22細(xì)胞在初診和Non-CR AML患者中的比例明顯升高,而Th22細(xì)胞在初診和Non-CR AML患者之間的比例無明顯差異。1.2 ELISA結(jié)果顯示,與正常對照組相比,IL-22在初診AML患者中的比例明顯升高,IL-22在Non-CR或CR AML患者中的表達(dá)無明顯改變。IL-22在初診和Non-CR AML患者之間的表達(dá)亦無明顯差異。2.Th17、純Th17細(xì)胞和IL-17在AML患者外周血和外周血血清中的表達(dá)。(1)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與正常對照組相比,Th17細(xì)胞在初診、Non-CR和CRAML患者中的水平均明顯升高,而Th17細(xì)胞在CR與初診AML患者或CR與Non-CR AML患者之間無明顯差異。(2)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與正常對照相比,純Th17細(xì)胞在初診和Non-CR AML患者中的水平均明顯升高。然而,純Th17細(xì)胞在初診和Non-CR AML患者之間的表達(dá)無明顯差異。(3) ELISA結(jié)果顯示,與正常對照相比,IL-17在初診、Non-CR和CR AML患者血清中的水平明顯降低。3.Th1細(xì)胞在AML患者外周血中的表達(dá)：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與正常對照相比,Th1細(xì)胞在初診AML患者中的比例明顯降低,在其他各組之間未見明顯差異。4.AML患者外周血中Th細(xì)胞以及與細(xì)胞因子IL-22、IL-17之間的相關(guān)分析。(1) Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示,在初診AML患者中,Th22和純Th17細(xì)胞呈明顯正相關(guān),Th22和Th1細(xì)胞呈明顯負(fù)相關(guān),而Th22和Th1細(xì)胞無顯著相關(guān)性。在Non-CR患者和CR患者中,Th22、Th17、純Th17和Th1細(xì)胞之間均無相關(guān)性。(2) Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示,在初診AML患者中,血漿IL-22濃度與純Th17細(xì)胞呈正相關(guān),而IL-22與Th17、Th1細(xì)胞及IL-17無明顯相關(guān)性。5. RORC在AML患者PBMCs中的mRNA表達(dá)及其與Th細(xì)胞的相關(guān)分析。(1) Real-time RT-PCR結(jié)果顯示,RORC在Non-CR AML患者中的mRNA表達(dá)明顯高于初診AML患者或正常對照。與正常對照相比,RORC在CR AML患者中的mRNA表達(dá)明顯升高。與之相比,RORC在Non-CR、CR和初診AML患者之間的mRNA表達(dá)無明顯差異。(2) Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示,在Non-CR AML患者中,RORC與Th22細(xì)胞呈正相關(guān),RORC與純Th17細(xì)胞接近正相關(guān)。6. Th22、Th17、純Th17及Thl細(xì)胞與AML患者臨床特征的相關(guān)分析：Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示,在初診AML患者中,Th22細(xì)胞與AML患者外周血原始細(xì)胞的比例呈顯著正相關(guān),Th1細(xì)胞與AML患者外周血原始細(xì)胞的比例呈顯著負(fù)相關(guān)。7.不同類型AML患者中Th22、Th17、純Th17和Th1細(xì)胞的表達(dá)：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,Th22、Th17和純Th17細(xì)胞在急性粒單核細(xì)胞白血病患者中的表達(dá)明顯高于急性單核細(xì)胞白血病患者。然而,Th1細(xì)胞在不同類型AML患者中的表達(dá)未見明顯差異。結(jié)論：1.AML患者外周血中存在Th22、Th17、純Th17和Th1細(xì)胞的異常表達(dá),Th22和純Th17細(xì)胞顯著正相關(guān),提示Th22和純Th17可能協(xié)同促進(jìn)AML發(fā)病。2. Non-CR AML患者中RORC與Th22、純Th17細(xì)胞呈正相關(guān),RORC可能參與Non-CR AML患者中Th22和純Th17細(xì)胞分化。3.初診AML患者中Th22細(xì)胞的高表達(dá)與外周血原始細(xì)胞的增高顯著正相關(guān),提示Th22可能是評估AML患者危險程度的一個新的生物學(xué)指標(biāo)。4.急性粒單核細(xì)胞白血病中存在Th22、Th17和純Th17的異常高表達(dá),Th細(xì)胞可能主要參與急性粒單核細(xì)胞白血病的發(fā)生發(fā)展。
【圖文】：

圖１．細(xì)胞免疫巧光方法檢測Ｙ－Ｈ２ＡＸ在化療藥物處理后的ＨＳ－５細(xì)胞中的表達(dá)逡逑

ＮＳ邐ＡＤＲ邐ＩＤＡ邐Ａｒａ－Ｃ逡逑Ｙ－Ｈ２ＡＸ－ＴＲＩＴＣ逡逑。？國WW■逡逑Ｍ。？國WW國逡逑ＨＳ－５逡逑圖１．細(xì)胞免疫巧光方法檢測Ｙ－Ｈ２ＡＸ在化療藥物處理后的ＨＳ－５細(xì)胞中的表達(dá)逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.71
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本文編號：2534905