【摘要】：胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是目前全球備受關(guān)注的惡性腫瘤之一,因其具有惡性程度較高,轉(zhuǎn)移早,手術(shù)機(jī)會(huì)少,容易復(fù)發(fā),死亡率高的特點(diǎn),故有“癌中之王”之稱。據(jù)統(tǒng)計(jì),2015年P(guān)C死亡率位于我國(guó)癌癥死因第九位。根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥中心預(yù)測(cè),至2030年,PC將攀升至癌癥死因排行榜第二位。PC的90%以上為胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC),且PDAC患者術(shù)后五年中位生存時(shí)間小于6個(gè)月。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,盡管醫(yī)學(xué)診斷和治療手段有所提高,但PDAC患者的預(yù)后沒有明顯改善,其五年生存率僅約7%。故我們對(duì)PDAC的深入研究的重要性不言而喻。近年來,研究已證實(shí)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non coding RNA,LncRNAs)參與人類正常發(fā)育和異常的病理生理過程;與包括腫瘤在內(nèi)的人類多種疾病有極其密切的聯(lián)系,并通過多種方式調(diào)控癌癥的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后。轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(metastasis-associated lung adenocarinoma transcript,MALAT1)是發(fā)現(xiàn)最早LncRNAs之一,位于染色體11q13.1上,轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)8708bp。研究發(fā)現(xiàn)MALAT1在人胰腺?肺等組織與其他正常組織相比較高表達(dá);在非小細(xì)胞肺癌?胰腺癌?前列腺癌等癌組織中與癌旁組織相比呈高表達(dá),其表達(dá)水平與總生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān);并在腫瘤發(fā)展中,發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等功能。然而在PDAC中MALAT1的研究甚少,其作用機(jī)制尚不清楚?因此,本課題將重點(diǎn)研究MALAT1在PDAC中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系,并在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討MALAT1對(duì)PDAC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其調(diào)控機(jī)制?應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量pcr(quantitativereal-timepolymerasechainreaction,qrt-pcr)技術(shù)檢測(cè)malat1mrna在45例pdac石蠟包埋組織(formalinfixedparaffinembedded,ffpe)和25例鄰近正常癌旁ffpe組織(adjacentnormaltissues,ant)中表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:malat1mrna在pdac組織中表達(dá)水平明顯高于ant(p=0.009)?應(yīng)用原位雜交(ish)發(fā)現(xiàn)malat1陽性率在pdac組織(77.8%,35/45)明顯高于ant(32%,8/25)(p=0.0019)。采用qrt-pcr檢測(cè)胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞系panc-1、miapaca-2、bxpc-3、canpan-1、aspc-1和永生化hpde6c-7細(xì)胞中malat1mrna的表達(dá),結(jié)果顯示:與hpde6c-7比較,malat1mrna表達(dá)水平在aspc-1細(xì)胞中呈高表達(dá)(p0.05);在bxpc-3、miapaca-2、canpan-1細(xì)胞中呈低表達(dá)(均p0.05);而在panc-1細(xì)胞中無顯著差異(p0.05)?臨床病理參數(shù)分析,將45例pdacffpe組織按腫瘤大小(4cm,≥4cm)、浸潤(rùn)深度(t1、t2和t3、t4)、腫瘤臨床分期(i、ii和iii、iv)進(jìn)行組間malat1mrna表達(dá)比較。結(jié)果顯示:malat1mrna表達(dá)在腫瘤≥4cm組明顯高于腫瘤4cm組(p=0.036);浸潤(rùn)較深組(t3、t4)明顯高于浸潤(rùn)較淺組(t1、t2)(p=0.014);臨床晚期組(iii、iv)明顯高于臨床早期組(i、ii)(p=0.0328)?按malat1mrna平均值將45例pdac分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,進(jìn)行相關(guān)性分析,其結(jié)果顯示:malat1表達(dá)與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、腫瘤臨床分期呈正相關(guān)(r=0.35,p=0.019;r=0.334,p=0.025;r=0.439,p=0.04);而與患者性別、年齡、腫瘤部位、組織分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移、靜脈侵襲、神經(jīng)侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤血清cea水平和腫瘤血清ca199等臨床因素?zé)o明顯相關(guān)性(p均0.05)?應(yīng)用kaplan-meier法繪制生存曲線顯示:malat1高表達(dá)組患者生存時(shí)間明顯短于低表達(dá)組患者生存時(shí)間(p=0.043)。單因素分析顯示:pdac的發(fā)病部位(hr=2.103,95%ci:0.98-4.650,p=0.013)、腫瘤的浸潤(rùn)深度(hr=2.136,95%ci:0.999-4.965,p=0.021)和malat1的表達(dá)水平(hr=1.505,95%ci:1.027-2.205,p=0.036)是獨(dú)立的預(yù)后因素。將單因素結(jié)果中p≤0.01的臨床參數(shù)納入cox分析回歸模型分析顯示:pdac的發(fā)病部位(hr=3.482,95%ci:1.414-8.547,p=0.007)、malat1mrna的表達(dá)水平(hr=1.798,95%ci:1.177-7.747,p=0.007)和神經(jīng)侵襲(hr=4.631,95%ci:1.86-11.553,p=0.001)是獨(dú)立的預(yù)后因素。roc曲線顯示:auc為0.69(95%ci:0.561-0.829,p=0.009),cut-off值為0.1035;malat1在pdacffep中診斷敏感性和特異性是分別為77.8%和60%?在體外實(shí)驗(yàn),設(shè)計(jì)malat1-shrna慢病毒表達(dá)載體,經(jīng)陽性克隆pcr鑒定、測(cè)序分析,結(jié)果顯示:針對(duì)malat1基因的4對(duì)shrna鏈分別成功與質(zhì)粒pglv3/h1/gfp+puro連接,成功構(gòu)建了慢病毒malat1-shrna表達(dá)載體。經(jīng)包裝、純化、濃縮后產(chǎn)生的慢病毒滴度為1×108tu/ml。4對(duì)慢病毒malat1-shrna轉(zhuǎn)染panc-1和miapaca-2細(xì)胞的抑制率為分別14%~61%和17.5%~73.6%,其中malat1-5416,malat1-5543的抑制率下降最為明顯,抑制率為61%和73.6%;經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選成功構(gòu)建了panc-1和miapaca-2細(xì)胞malat1敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)株。通過qrt-pcr驗(yàn)證,panc-1和miapaca-2細(xì)胞malat1敲除率分別為63%和72%。細(xì)胞功能學(xué)cck-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:敲除malat1后,panc-1和miapaca-2組細(xì)胞增殖與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比明顯減慢(p0.001)。平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示:敲除malat1后,panc-1和miapaca-2細(xì)胞克隆形成能力明顯弱于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(p0.05)。transwell細(xì)胞體外遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:敲除malat1后,panc-1和miapaca-2細(xì)胞遷移到濾膜下表面細(xì)胞數(shù)量明減少空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(p0.05);同時(shí)transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:敲除malat1后,panc-1和miapaca-2細(xì)胞穿膜數(shù)量明顯少于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(p0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:panc-1和miapaca-2早期凋亡率分別為26.93%3±1.74%、58.7%±4.4%,明顯高于各自空白對(duì)照組或陰性對(duì)照組(p0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)panc-1和miapaca-2與各自空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組dna比例無明顯差異(p0.05)。在體內(nèi),敲減malat1抑制panc-1細(xì)胞的小鼠移植瘤生長(zhǎng)。敲減malat1后,通過免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)通路蛋白,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:miapaca-2細(xì)胞與陰性對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)錄因子fos蛋白表達(dá)蛋白吸光度值下調(diào)49.4%,fgfr2的配體fgf2蛋白表達(dá)顯著上調(diào),cav1蛋白表達(dá)蛋白吸光度值上調(diào)310.1%?而panc-1細(xì)胞fos蛋白表達(dá)蛋白吸光度值下調(diào)30.6%,fgf2蛋白表達(dá)蛋白吸光度值上調(diào)67%;cav1蛋白表達(dá)上調(diào)蛋白吸光度值74%。其他egfr、itga6、vecfc、met和rap1等蛋白均無明顯變化。以上結(jié)果提示:malat1可能通過調(diào)節(jié)fos/fgf2或cav1等基因的表達(dá)而調(diào)控pdac細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物學(xué)功能。由于慢病毒介導(dǎo)malat1-shrna敲減malat1,后期出現(xiàn)malat1基因回調(diào),導(dǎo)致malat1敲減率不穩(wěn)定。因此,本研究應(yīng)用crispr/cas9技術(shù)在直腸癌hct116wt二倍體細(xì)胞探索敲除和激活非常編碼malat1體系。該技術(shù)是目前能克服其他轉(zhuǎn)染方法(sirna、shrna)干擾效率較低、靶基因晚期上調(diào)、脫靶的效應(yīng)及talen激活體系的缺陷。本研究首次構(gòu)建dual-grnamalat1的敲除載體和dcas9-sgrna激活malat1的過表達(dá)載體,并成功構(gòu)建攜帶malat1基因特異性crispr/cas9敲除和激活穩(wěn)轉(zhuǎn)株;dual-grna敲除malat1,敲除率達(dá)99%;dcas9sgrna激活malat1,malat水平增加500%-700%。同時(shí),在體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:CRISPR/Cas9敲除MALAT1和激活MALAT1后,HCT116WT細(xì)胞增殖?克隆形成能力與對(duì)照組相比分別被抑制和增強(qiáng)(P0.05);CRISPR/Cas9敲除和激活MALAT1后,twist和snail mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組相比分別降低和增加(P0.05);MALAT1挽救實(shí)驗(yàn)顯示:twist、snail的mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組相(P0.05)。最后經(jīng)TNFa誘導(dǎo)MALAT1敲除HCT116WT細(xì)胞,敲除組MALAT1P65蛋白水平無變化,而對(duì)照組P65蛋白水平增高。這些提示敲除MALAT1后,可能致NF-kB通道失活和導(dǎo)致核內(nèi)twsit?snail定位減少,從而抑制HCT116wt細(xì)胞增殖和遷移?總之,MALAT1在PDAC組織中和部分細(xì)胞高表達(dá);其表達(dá)與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、腫瘤臨床分期病情進(jìn)展因素呈正相關(guān);MALAT1表達(dá)與生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān);MALAT1有潛在作為病情評(píng)估的指標(biāo),是獨(dú)立的預(yù)后因素。在體外,敲減MALAT1后,PDAC細(xì)胞增殖能力和克隆能力減弱;遷移、侵襲能力降低,抗凋亡能力減弱。在體內(nèi),敲減MALAT1,PANC-1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。敲減MALAT1后,PDAC細(xì)胞中FOS蛋白表達(dá)水平下降和CVA1及FGR2的蛋白水平表達(dá)增加,由此推測(cè):MALAT1可能通過調(diào)節(jié)FOS/FGF2或CAV1等基因的表達(dá)來激活ERK/MAPK信號(hào)通路,從而調(diào)控PDAC細(xì)胞生長(zhǎng)?侵襲?遷移和凋亡。同時(shí),成功構(gòu)建dual-gRNA敲除和dCas9-sgRNA激活過表達(dá)MALAT1體系;CRISPR/Cas9技術(shù)將為為PDAC癌的基因研究和藥物靶向治療帶來新的希望。
【圖文】：

提示引物特異性好,無非特異性擴(kuò)增（圖 1引物擴(kuò)增準(zhǔn)確 隨機(jī)取 qRT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)內(nèi)參基因的擴(kuò)增片段與預(yù)期相符,分別為 ）, qRT-PCR 的產(chǎn)物唯一,無其他 DNA 污染

-1-2MALAT1 基因(上)和內(nèi)參 GAPDH 基因(下)的 qRT-PCR 擴(kuò)增和溶解 1-1-2The amplification carve melting point of MALAT1 and GAPDH in q圖 1-1-3MALAT1(左)和 GAPDH(右)的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖re 1-1-3The electrophoretogram of MALAT1 and GAPDH amplification pLAT1 在
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.9
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本文編號(hào)：2533950