【摘要】：研究背景和目的:腎細(xì)胞癌是腎組織腫瘤中最常見的一種腫瘤,其中50%以上的腎癌患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移。因此,為了準(zhǔn)確判斷預(yù)后及對(duì)病人實(shí)行個(gè)體化治療,進(jìn)一步了解腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機(jī)制及篩選腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)生物標(biāo)記物成了當(dāng)務(wù)之急。近年來,越來越多的研究顯示腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子,尤其是腫瘤壞死因子a會(huì)增強(qiáng)腎癌的運(yùn)動(dòng)能力,進(jìn)而增加腎癌的轉(zhuǎn)移。然而,其調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不明確。Rictor是組成mTORC2的關(guān)鍵分子,其功能涉及到調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞存活和增殖等方面上。我們課題組之前的研究表明m TORC2中的Rictor在乳腺癌組織中高表達(dá),并與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)密切相關(guān),降低腫瘤細(xì)胞中Rictor的表達(dá)可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移。但是目前有關(guān)m TORC2/Rictor的功能研究還處于初步探討階段,尤其在腎癌運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移方面的研究更為有限。本研究第一部分主要通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討Rictor在腎癌轉(zhuǎn)移的功能作用。本研究第二部分則運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,研究促炎因子TNFa處理對(duì)腎癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響,以及Rictor在該過程中的功能及其分子機(jī)制,以明確Rictor在TNFa促進(jìn)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)這一現(xiàn)象中的作用。希望本研究能深化人們對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的認(rèn)識(shí),力求能為臨床提早發(fā)現(xiàn)和治療腫瘤轉(zhuǎn)移提供新的思路、觀點(diǎn)和依據(jù)。研究方法:1)應(yīng)用慢病毒包裝系統(tǒng)感染人腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN,利用Western Blotting和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)Rictor降表達(dá)效率。2)利用劃痕實(shí)驗(yàn)、趨化實(shí)驗(yàn)以及侵襲實(shí)驗(yàn)觀察穩(wěn)定降表達(dá)Rictor細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力的變化。3)利用嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠建立腫瘤移植瘤轉(zhuǎn)移模型,根據(jù)小鼠肝、肺組織HE染色結(jié)果研究下調(diào)Rictor的表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響,并通過計(jì)算原發(fā)瘤體積初步評(píng)估下調(diào)Rictor的表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞增殖能力的影響。4)應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)、趨化實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察TNFa處理后ACHN細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的改變,以及降表達(dá)Rictor對(duì)TNFa處理后ACHN細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響。5)應(yīng)用Western Blotting和實(shí)時(shí)定量技術(shù)檢測(cè)TNFa處理后ACHN細(xì)胞內(nèi)Rictor的表達(dá)情況。6)應(yīng)用Western Blotting和免疫熒光技術(shù)分別檢測(cè)TNFa處理后ACHN細(xì)胞內(nèi)IkBa的含量和磷酸化的變化,以及p65細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位的情況。7)應(yīng)用螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)和染色體免疫共沉淀技術(shù)分析RICTOR啟動(dòng)位點(diǎn)上游序列,以探究RICTOR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。結(jié)果:1)慢病毒感染后,ACHN細(xì)胞內(nèi)Rictor表達(dá)量明顯下調(diào)。2)穩(wěn)定降表達(dá)Rictor的ACHN細(xì)胞相比空白組和對(duì)照組運(yùn)動(dòng)能力明顯減弱。3)穩(wěn)定降表達(dá)Rictor的ACHN細(xì)胞在小鼠肺和肝臟轉(zhuǎn)移少于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組,且穩(wěn)定降表達(dá)Rictor的腎癌細(xì)胞相比對(duì)照組在小鼠體內(nèi)的成瘤能力降低。4)TNFa處理能增強(qiáng)AHCN對(duì)照組細(xì)胞的遷移和EGF誘導(dǎo)下的趨化和侵襲能力,而降表達(dá)Rictor能夠抑制TNFa處理對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的增強(qiáng)作用。5)Western Blotting和RT-PCR結(jié)果證實(shí)TNFa處理可以在m RNA和蛋白水平上增加ACHN細(xì)胞內(nèi)Rictor表達(dá)。6)Western Blotting結(jié)果顯示TNFa處理后,ACHN細(xì)胞中的IkBa表達(dá)量可見明顯降低,而磷酸化的IkBa可見明顯升高。免疫熒光結(jié)果則證實(shí)TNFa處理后,轉(zhuǎn)錄因子p65從胞漿轉(zhuǎn)位至胞核。7)螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示RICTOR轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-51bp至-301bp區(qū)域的缺失時(shí),該序列的轉(zhuǎn)錄活性明顯下降。染色體免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步證實(shí)p65能富集在該區(qū)域。結(jié)論:1)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示Rictor與腎癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力和增殖能力相關(guān),降表達(dá)Rictor可以抑制腎癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移能力和成瘤能力。??TNF?能夠激活A(yù)CHN細(xì)胞中NF-?B通路,進(jìn)而增加細(xì)胞內(nèi)Rictor表達(dá)量,從而實(shí)現(xiàn)其增強(qiáng)腎癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的作用,降表達(dá)Rictor能夠抑制TNF?對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的促進(jìn)作用。?
【圖文】：

圖遷移垂直能力不同養(yǎng)液干擾區(qū)域細(xì)胞（圖拍攝圖1 A ：利用劃痕實(shí)驗(yàn)移的生物學(xué)直于傷口劃力變化的一同時(shí)間點(diǎn)在液更換成只擾。劃痕實(shí)域所用的時(shí)胞遷移的距圖 2A）。圖攝的劃痕愈1 慢病毒感用 Western B時(shí)定量 P驗(yàn)又稱傷口愈學(xué)過程，當(dāng)人劃痕的方向運(yùn)一個(gè)簡(jiǎn)單有效在固定位置上含 0.5%血實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示時(shí)間將會(huì)更長距離分別是圖 2 B 則為劃愈合情況，可感染后建立Blotting 檢測(cè)CR 檢測(cè)各愈合實(shí)驗(yàn)，人體內(nèi)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)，這一效的方法[63上測(cè)量細(xì)胞清的培養(yǎng)液示降表達(dá) R長。劃痕 240.495±0.0劃痕后 0 小可見空白組立的穩(wěn)定細(xì)胞測(cè)各組細(xì)胞各組細(xì)胞中 R這個(gè)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)創(chuàng)傷時(shí)，通一過程屬于3, 64]。我們?cè)诎騻诜揭�，并觀察Rictor 后，4 小時(shí)后，052mm，0.4小時(shí)和 24 小組、對(duì)照組胞系中 Rict胞中 Rictor 的Rictor 的表模仿了體內(nèi)通過重組微細(xì)胞的定向在單層細(xì)胞向遷移距離24 小時(shí)，以相比對(duì)照組空白組、對(duì)458±0.051小時(shí)，各組細(xì)細(xì)胞劃痕處or 的表達(dá)情的表達(dá)情況表達(dá)情況。內(nèi)創(chuàng)傷愈合微管組織中心向遷移，是胞上創(chuàng)造一個(gè)離。在劃痕以排除細(xì)胞組，細(xì)胞填對(duì)照組細(xì)胞1mm 和 0.2細(xì)胞分別在處細(xì)胞間隙情況況；B ：利用合時(shí)的細(xì)胞向心 (MTOC)是研究細(xì)胞遷個(gè)“傷口”，痕后，我們將胞增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)填滿中間劃痕胞和 shRicto238±0.078在各自同一位隙明顯小于降用實(shí)向外) 沿遷移，在將培驗(yàn)的痕胞or 組8mm位置降表

圖該實(shí)差表些化運(yùn)動(dòng)苯酚育和關(guān)重我們動(dòng)的Cha2 A：劃痕實(shí)實(shí)驗(yàn)至少重表示；B ：趨化運(yùn)動(dòng)化學(xué)物質(zhì)濃動(dòng)，例如，細(xì)酚）濃度變和發(fā)展（如重要[65]。此們組之前的的能力（數(shù)amber) 來檢圖 2 降表實(shí)驗(yàn)分析空重復(fù) 3 次，圖片顯示劃動(dòng)是指體細(xì)胞濃度梯度而運(yùn)細(xì)菌可以根變化而逃離有如精子在受精此外，人們的研究顯示在數(shù)據(jù)未發(fā)表檢測(cè)細(xì)胞的表達(dá) Rictor 對(duì)空白組、對(duì)照?qǐng)D中數(shù)據(jù)來劃痕實(shí)驗(yàn) 0胞、細(xì)菌、運(yùn)動(dòng)。對(duì)于根據(jù)葡萄糖有害環(huán)境。精過程中向已經(jīng)認(rèn)識(shí)到在腎癌細(xì)胞）。在本研的趨化運(yùn)動(dòng)能ACHN 細(xì)照組及降表達(dá)來自最有代表小時(shí)與 24情況。其他單細(xì)于原核細(xì)胞的濃度變化在多細(xì)胞向卵子運(yùn)動(dòng)到，該機(jī)制胞中，EGF 較研究中，我能力。該方細(xì)胞遷移能達(dá) Rictor 組表性的實(shí)驗(yàn)小時(shí) Ricto胞或多細(xì)胞來講，這是化而尋找食物生物體中，和神經(jīng)細(xì)胞在癌癥轉(zhuǎn)移CXCL12們通過濾膜方法通常用能力的影響組細(xì)胞遷移驗(yàn)，數(shù)據(jù)用平or 各組細(xì)胞胞生物體根是一種非常物，也可以趨化運(yùn)動(dòng)胞或淋巴細(xì)移中發(fā)揮著2 具有更強(qiáng)膜小室法 (48 孔的趨能力的變化平均值和標(biāo)胞劃痕處的愈根據(jù)環(huán)境中的常重要的生物以根據(jù)毒物動(dòng)對(duì)生物體的細(xì)胞的遷移）著重要的作用強(qiáng)的誘導(dǎo)趨化(Micro-Boy趨化小室進(jìn)行化 ，，標(biāo)準(zhǔn)愈合的某物學(xué)（如的發(fā)）至用�；\(yùn)yden行實(shí)
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.11

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2533803