【摘要】：研究背景和目的:腎細胞癌是腎組織腫瘤中最常見的一種腫瘤,其中50%以上的腎癌患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移。因此,為了準確判斷預(yù)后及對病人實行個體化治療,進一步了解腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機制及篩選腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)生物標記物成了當(dāng)務(wù)之急。近年來,越來越多的研究顯示腫瘤微環(huán)境中的細胞因子,尤其是腫瘤壞死因子a會增強腎癌的運動能力,進而增加腎癌的轉(zhuǎn)移。然而,其調(diào)節(jié)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的機制尚不明確。Rictor是組成mTORC2的關(guān)鍵分子,其功能涉及到調(diào)節(jié)細胞骨架重構(gòu)、細胞遷移、細胞存活和增殖等方面上。我們課題組之前的研究表明m TORC2中的Rictor在乳腺癌組織中高表達,并與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)密切相關(guān),降低腫瘤細胞中Rictor的表達可以明顯抑制腫瘤細胞的運動和轉(zhuǎn)移。但是目前有關(guān)m TORC2/Rictor的功能研究還處于初步探討階段,尤其在腎癌運動轉(zhuǎn)移方面的研究更為有限。本研究第一部分主要通過體內(nèi)外實驗探討Rictor在腎癌轉(zhuǎn)移的功能作用。本研究第二部分則運用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)實驗方法,研究促炎因子TNFa處理對腎癌細胞運動能力的影響,以及Rictor在該過程中的功能及其分子機制,以明確Rictor在TNFa促進腫瘤細胞運動這一現(xiàn)象中的作用。希望本研究能深化人們對腫瘤轉(zhuǎn)移分子機制的認識,力求能為臨床提早發(fā)現(xiàn)和治療腫瘤轉(zhuǎn)移提供新的思路、觀點和依據(jù)。研究方法:1)應(yīng)用慢病毒包裝系統(tǒng)感染人腎癌細胞系A(chǔ)CHN,利用Western Blotting和實時定量PCR技術(shù)檢測Rictor降表達效率。2)利用劃痕實驗、趨化實驗以及侵襲實驗觀察穩(wěn)定降表達Rictor細胞的運動能力的變化。3)利用嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠建立腫瘤移植瘤轉(zhuǎn)移模型,根據(jù)小鼠肝、肺組織HE染色結(jié)果研究下調(diào)Rictor的表達對腎癌細胞轉(zhuǎn)移能力的影響,并通過計算原發(fā)瘤體積初步評估下調(diào)Rictor的表達對腎癌細胞增殖能力的影響。4)應(yīng)用劃痕實驗、趨化實驗和侵襲實驗觀察TNFa處理后ACHN細胞運動能力的改變,以及降表達Rictor對TNFa處理后ACHN細胞運動能力的影響。5)應(yīng)用Western Blotting和實時定量技術(shù)檢測TNFa處理后ACHN細胞內(nèi)Rictor的表達情況。6)應(yīng)用Western Blotting和免疫熒光技術(shù)分別檢測TNFa處理后ACHN細胞內(nèi)IkBa的含量和磷酸化的變化,以及p65細胞內(nèi)轉(zhuǎn)位的情況。7)應(yīng)用螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)和染色體免疫共沉淀技術(shù)分析RICTOR啟動位點上游序列,以探究RICTOR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。結(jié)果:1)慢病毒感染后,ACHN細胞內(nèi)Rictor表達量明顯下調(diào)。2)穩(wěn)定降表達Rictor的ACHN細胞相比空白組和對照組運動能力明顯減弱。3)穩(wěn)定降表達Rictor的ACHN細胞在小鼠肺和肝臟轉(zhuǎn)移少于實驗對照組,且穩(wěn)定降表達Rictor的腎癌細胞相比對照組在小鼠體內(nèi)的成瘤能力降低。4)TNFa處理能增強AHCN對照組細胞的遷移和EGF誘導(dǎo)下的趨化和侵襲能力,而降表達Rictor能夠抑制TNFa處理對細胞運動的增強作用。5)Western Blotting和RT-PCR結(jié)果證實TNFa處理可以在m RNA和蛋白水平上增加ACHN細胞內(nèi)Rictor表達。6)Western Blotting結(jié)果顯示TNFa處理后,ACHN細胞中的IkBa表達量可見明顯降低,而磷酸化的IkBa可見明顯升高。免疫熒光結(jié)果則證實TNFa處理后,轉(zhuǎn)錄因子p65從胞漿轉(zhuǎn)位至胞核。7)螢光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示RICTOR轉(zhuǎn)錄起始位點上游-51bp至-301bp區(qū)域的缺失時,該序列的轉(zhuǎn)錄活性明顯下降。染色體免疫共沉淀實驗則進一步證實p65能富集在該區(qū)域。結(jié)論:1)體內(nèi)外實驗顯示Rictor與腎癌細胞轉(zhuǎn)移能力和增殖能力相關(guān),降表達Rictor可以抑制腎癌細胞的運動轉(zhuǎn)移能力和成瘤能力。??TNF?能夠激活A(yù)CHN細胞中NF-?B通路,進而增加細胞內(nèi)Rictor表達量,從而實現(xiàn)其增強腎癌細胞運動能力的作用,降表達Rictor能夠抑制TNF?對細胞運動的促進作用。?
【圖文】：

圖遷移垂直能力不同養(yǎng)液干擾區(qū)域細胞（圖拍攝圖1 A ：利用劃痕實驗移的生物學(xué)直于傷口劃力變化的一同時間點在液更換成只擾。劃痕實域所用的時胞遷移的距圖 2A）。圖攝的劃痕愈1 慢病毒感用 Western B時定量 P驗又稱傷口愈學(xué)過程，當(dāng)人劃痕的方向運一個簡單有效在固定位置上含 0.5%血實驗結(jié)果顯示時間將會更長距離分別是圖 2 B 則為劃愈合情況，可感染后建立Blotting 檢測CR 檢測各愈合實驗，人體內(nèi)出現(xiàn)運動，這一效的方法[63上測量細胞清的培養(yǎng)液示降表達 R長。劃痕 240.495±0.0劃痕后 0 小可見空白組立的穩(wěn)定細胞測各組細胞各組細胞中 R這個實驗現(xiàn)創(chuàng)傷時，通一過程屬于3, 64]。我們在胞向傷口方液，并觀察Rictor 后，4 小時后，052mm，0.4小時和 24 小組、對照組胞系中 Rict胞中 Rictor 的Rictor 的表模仿了體內(nèi)通過重組微細胞的定向在單層細胞向遷移距離24 小時，以相比對照組空白組、對458±0.051小時，各組細細胞劃痕處or 的表達情的表達情況表達情況。內(nèi)創(chuàng)傷愈合微管組織中心向遷移，是胞上創(chuàng)造一個離。在劃痕以排除細胞組，細胞填對照組細胞1mm 和 0.2細胞分別在處細胞間隙情況況；B ：利用合時的細胞向心 (MTOC)是研究細胞遷個“傷口”，痕后，我們將胞增殖對實驗填滿中間劃痕胞和 shRicto238±0.078在各自同一位隙明顯小于降用實向外) 沿遷移，在將培驗的痕胞or 組8mm位置降表

圖該實差表些化運動苯酚育和關(guān)重我們動的Cha2 A：劃痕實實驗至少重表示；B ：趨化運動化學(xué)物質(zhì)濃動，例如，細酚）濃度變和發(fā)展（如重要[65]。此們組之前的的能力（數(shù)amber) 來檢圖 2 降表實驗分析空重復(fù) 3 次，圖片顯示劃動是指體細胞濃度梯度而運細菌可以根變化而逃離有如精子在受精此外，人們的研究顯示在數(shù)據(jù)未發(fā)表檢測細胞的表達 Rictor 對空白組、對照圖中數(shù)據(jù)來劃痕實驗 0胞、細菌、運動。對于根據(jù)葡萄糖有害環(huán)境。精過程中向已經(jīng)認識到在腎癌細胞）。在本研的趨化運動能ACHN 細照組及降表達來自最有代表小時與 24情況。其他單細于原核細胞的濃度變化在多細胞向卵子運動到，該機制胞中，EGF 較研究中，我能力。該方細胞遷移能達 Rictor 組表性的實驗小時 Ricto胞或多細胞來講，這是化而尋找食物生物體中，和神經(jīng)細胞在癌癥轉(zhuǎn)移CXCL12們通過濾膜方法通常用能力的影響組細胞遷移驗，數(shù)據(jù)用平or 各組細胞胞生物體根是一種非常物，也可以趨化運動胞或淋巴細移中發(fā)揮著2 具有更強膜小室法 (48 孔的趨能力的變化平均值和標胞劃痕處的愈根據(jù)環(huán)境中的常重要的生物以根據(jù)毒物動對生物體的細胞的遷移）著重要的作用強的誘導(dǎo)趨化(Micro-Boy趨化小室進行化 ，，標準愈合的某物學(xué)（如的發(fā)）至用。化運yden行實
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.11

【共引文獻】

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本文編號：2533803