【摘要】：乳腺癌是全世界的女性中發(fā)病率最高的癌癥。早期檢測可有效降低乳腺癌患者死亡率,然而由于當前缺乏有效的識別早期乳腺癌的腫瘤生物標志物,乳腺癌早期檢測的手段的準確性還稍顯不足。具有RNA剪切功能的熒光脫氧核酶(RFDs)是一種具有催化剪切RNA功能的DNA分子,可以通過與特定的靶標結(jié)合產(chǎn)生催化作用,并利用RNA的剪切產(chǎn)生增強的熒光信號。RFD分子可以通過指數(shù)富集的系統(tǒng)配體進化(SELEX)過程獲得。本論文主要圍繞與乳腺癌相關(guān)的熒光標記功能核酸,建立了針對乳腺癌及其相關(guān)分子的新型檢測技術(shù)。主要結(jié)果如下:利用SELEX過程篩選出可以對乳腺癌細胞MDA-MB-231產(chǎn)生應答的RFD分子探針AAI2-5。該探針可以對低至0.5μg/mL的MDA-MB-231蛋白進行檢測(相當于約5,000 cell/mL)。利用熒光偏振檢測其Kd值為103.7±8.4μg/m L。利用蛋白酶解的方式證明其靶標為蛋白分子。分子篩截留蛋白實驗確定其靶標蛋白分子量為50 kDa以上。胞質(zhì)/胞核實驗顯示其靶標位于細胞質(zhì)內(nèi)。該探針可以對MDA-MB-231細胞與其他細胞系進行區(qū)分,包括正常細胞、其他類型的腫瘤細胞,甚至其他乳腺癌細胞亞型。此外,AAI2-5可以對90%以上的臨床乳腺腫瘤組織樣本產(chǎn)生應答。本實驗首次實現(xiàn)了可檢測腫瘤細胞的RFD分子的篩選,表明RFD今后在臨床診斷和治療中具有應用的潛力。利用SELEX過程篩選出特異性針對雌激素受體蛋白的RFD分子探針ER-3。這是第一個利用單純蛋白通過體外篩選得到的RFD分子探針。接下來通過對不同二價離子、離子濃度、反應溫度、反應體系pH及反應時間的優(yōu)化,優(yōu)化了該探針檢測雌激素受體蛋白的反應條件。ER-3可對低至0.8μg/mL的ER蛋白產(chǎn)生催化作用,顯示出了良好的靈敏度,有望通過進一步對實體病例樣本的研究,向臨床檢測乳腺癌及乳腺癌分型上進一步發(fā)展�；跓晒夂怂徇m配體及石墨烯建立了一種具有變構(gòu)效應的ATP檢測方法,通過利用核酸外切酶III的剪切產(chǎn)物來放大熒光信號,與其他未進行信號放大的基于石墨烯及ATP的核酸適配體檢測方法相比,顯著提高了ATP檢測的靈敏度。實驗證實該方法具有高度的特異性,不易受蛋白干擾,有望應用于實體生物樣本的檢測。
【學位授予單位】：清華大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9;O657.3

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本文編號：2530174