【摘要】：在所有的實(shí)體瘤中肺癌的死亡率最高，生存率最低，是男性癌癥死亡的主要原因，是女性癌癥死亡的第二大原因。一般來說，肺癌可以分為兩種主要的類型：小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）。其中，NSCLC大約占到80%。隨著工業(yè)化速度加快、環(huán)境污染加重、人口老齡化加劇，肺癌的癌癥負(fù)擔(dān)日益加重。因此，肺癌的預(yù)防和治療已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界亟待解決的問題。放射治療是肺癌治療的有效手段，在國內(nèi)外已被廣泛研究和應(yīng)用。與小細(xì)胞肺癌相比，NSCLC對放療更易產(chǎn)生耐受，因此提高非小細(xì)胞肺癌的輻射敏感性是目前急需解決的問題，與此同時(shí)分子靶向治療在肺癌治療上取得了重大突破。然而，miR-9在非小細(xì)胞肺癌中的臨床意義尚不清楚。Himanshu等的研究表明，從H1299細(xì)胞照射后的表達(dá)譜不難發(fā)現(xiàn)，miR-9在受到電離輻射后表達(dá)水平降低。同時(shí)該研究也發(fā)現(xiàn)，miR-9可以通過靶向調(diào)控NF-κB1提高肺癌細(xì)胞的輻射敏感性。NRP1是一種跨膜糖蛋白，在多種腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)，且與腫瘤的惡性度呈正相關(guān)。生物信息學(xué)分析顯示，miR-9和NRP1具有靶向關(guān)系，而NRP1是一輻射抗性基因可引起腫瘤細(xì)胞的輻射抵抗。miR-9能否靶向調(diào)控NRP1提高A549細(xì)胞的輻射敏感性？有待于進(jìn)一步探討。 本研究采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、Western-blot、qRT-PCR、克隆形成和Transwell等實(shí)驗(yàn)方法探討miR-9與NRP1的靶向關(guān)系以及miR-9增強(qiáng)A549細(xì)胞放射敏感性的分子機(jī)制。首先，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，過表達(dá)miR-9可以靶向調(diào)控NRP1，在mRNA以及蛋白水平上可以抑制NRP1的表達(dá)。其次，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-9過表達(dá)細(xì)胞模型從細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、侵襲能力、克隆形成等方面檢測miR-9靶向調(diào)控NRP1增強(qiáng)A549細(xì)胞的輻射敏感性的各種指標(biāo)。最后，探討miR-9增強(qiáng)A549細(xì)胞輻射敏感性的信號通路機(jī)制。結(jié)果顯示，miR-9可以抑制A549細(xì)胞的增殖以及遷移、侵襲能力，并通過PI3KⅠ-AKT、MARK-ERK、P38、NF-κB等多條信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用，提高A549細(xì)胞的放射敏感性。本研究通過探討miR-9對A549細(xì)胞射敏感性方面的影響，闡明其可能的信號通路機(jī)理，期望為提高非小細(xì)胞肺癌的放射治療效果提供新的治療靶點(diǎn)。
【圖文】：

圖 3.1 miR-9 與靶基因 NRP1 結(jié)合位點(diǎn)及突變位點(diǎn) 1.2 pEZX-MT05-NRP1-3'UTR 質(zhì)粒的構(gòu)建我們以 A549 基因組 DNA 為模板，設(shè)計(jì)引物(含 Acc65I 和 Xhol 酶切)PCR 擴(kuò)增 NRP1-3'UTR 片段 (2600bp) PCR 產(chǎn)物純化后與 pEZX-MT05 同時(shí)cc65I 和 Xhol 雙 酶 切 、 連 接 并 定 向 克 隆 構(gòu) 建 重 組 質(zhì) 粒 。 重 組 質(zhì)ZX-MT05-NRP1-3'UTR 經(jīng) Acc65I 和 Xhol 雙 酶 切 后 出 現(xiàn) 的 小 片 段RP1-3'UTR 片段大小相當(dāng)，經(jīng) DNA 測序鑒定與設(shè)計(jì)序列完全一致，說明重粒 pEZX-MT05-NRP1-3'UTR 構(gòu)建成功。

圖 3.1 miR-9 與靶基因 NRP1 結(jié)合位點(diǎn)及突變位點(diǎn) 3.1.2 pEZX-MT05-NRP1-3'UTR 質(zhì)粒的構(gòu)建我們以 A549 基因組 DNA 為模板，設(shè)計(jì)引物(含 Acc65I 和 Xhol 酶切位點(diǎn))PCR 擴(kuò)增 NRP1-3'UTR 片段 (2600bp) PCR 產(chǎn)物純化后與 pEZX-MT05 同時(shí)行Acc65I 和 Xhol 雙 酶 切 、 連 接 并 定 向 克 隆 構(gòu) 建 重 組 質(zhì) 粒 。 重 組 質(zhì) 粒pEZX-MT05-NRP1-3'UTR 經(jīng) Acc65I 和 Xhol 雙 酶 切 后 出 現(xiàn) 的 小 片 段 與NRP1-3'UTR 片段大小相當(dāng)，，經(jīng) DNA 測序鑒定與設(shè)計(jì)序列完全一致，說明重組質(zhì)粒 pEZX-MT05-NRP1-3'UTR 構(gòu)建成功。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Identification of plasma microRNA-21 as a biomarker for early detection and chemosensitivity of non-small cell lung cancer[J];癌癥;2011年06期

本文編號：2529922