【摘要】：研究目的:1.研究Bcl-2家族抑制劑Sabutoclax(Sab)對于多種人類乳腺癌敏感細胞系和耐藥細胞系的殺傷作用,探討Sab對于乳腺癌耐藥細胞的抑制增殖及誘導凋亡作用。2.研究Sab對耐藥乳腺癌干細胞的殺傷作用,進一步探索Sab克服乳腺癌耐藥的作用機制。3.泛Bcl-2家族抑制劑Sab聯(lián)合常規(guī)化療藥物多柔比星(DOX)/依托泊苷(VP-16),研究聯(lián)合用藥對于乳腺癌化療耐藥細胞的協(xié)同抑制作用。研究方法:1.使用細胞增殖實驗(MTT)方法,比較Sab及多種傳統(tǒng)化療藥物對化療敏感的乳腺癌細胞系及其相對應的耐藥細胞系之間的藥物敏感性差異;通過平板克隆形成實驗,評價Sab對乳腺癌敏感細胞系MCF-7及Cal51和多藥耐藥細胞系MCF-7/A02及CALDOX的長效敏感性差異。2.通過Annexin V/PI染色法檢測Sab和依托泊苷對敏感及耐藥乳腺癌細胞的凋亡誘導作用;利用Caspase-3/7活性檢測以及Caspase-9檢測法檢測Sab對耐藥乳腺癌細胞早期凋亡的誘導作用;使用實時定量PCR法檢測耐藥細胞系中Sab處理前后凋亡通路相關基因的m RNA水平變化;采用Western blotting檢測不同細胞系中抗凋亡信號轉導通路活性及Sab處理后凋亡相關蛋白的表達改變,誘導耐藥細胞凋亡的IL-6/STAT3信號通路活性變化。3.采用實時定量PCR法檢測耐藥細胞系在Sab處理前后干細胞相關標志物m RNA水平變化;采用流式細胞儀檢測Sab處理前后乳腺癌耐藥細胞系MCF-7/A02和CALDOX中干樣細胞CD44+/CD24-及ALDH+比例變化。4.利用球囊培養(yǎng)技術與軟瓊脂克隆形成實驗檢測耐藥細胞系MCF-7/A02和CALDOX經(jīng)Sab處理后,干細胞比例與增殖能力變化。5.采用免疫組化方法檢測乳腺癌患者腫瘤組織離體后,在體外經(jīng)Sab處理后,信號轉導通路活性及相關凋亡蛋白的改變。6.利用MTT方法檢測Sab聯(lián)合多柔比星/依托泊苷對乳腺癌耐藥細胞系的作用,運用Calcusyn軟件,計算藥物聯(lián)合指數(shù)(combination index,CI)以明確雙藥聯(lián)合是否均有協(xié)同增效作用;通過平板克隆形成實驗,評價Sab聯(lián)合多柔比星對乳腺癌耐藥細胞系MCF-7/A02及CALDOX的協(xié)同抑制作用。通過Annexin V/PI染色法檢測Sab聯(lián)合VP16對耐藥乳腺癌細胞的凋亡誘導作用。結果:1.以乳腺癌敏感細胞系MCF-7和Cal51以及相對應耐藥細胞系MCF-7/A02和CALDOX為研究對象,MTT實驗結果顯示Sab對于敏感及耐藥細胞系均具有明顯抑制作用,且抑制作用呈濃度依賴性。耐藥指數(shù)僅為1.6~3.3之間,而多柔比星等常規(guī)細胞毒性化療藥物的耐藥指數(shù)約40~60,遠高于Sab。平板克隆形成實驗結果表明,多柔比星對于耐藥細胞抑制作用較差,而Sab對于上述4種細胞均具有長效抑制作用,可有效抑制耐藥細胞的增殖能力。2.通過Annexin V/PI染色法檢測顯示細胞毒性化療藥物依托泊苷可誘導乳腺癌敏感細胞凋亡,而相同劑量下耐藥細胞系則表現(xiàn)為耐受,凋亡變化不顯著。相同劑量Sab對乳腺癌敏感及耐藥細胞系均具有誘導凋亡作用。Caspase-3/7活性檢測以及Caspase-9檢測法表明小于半數(shù)抑制率劑量的Sab即可誘導乳腺癌耐藥細胞凋亡并呈濃度依賴性。PCR結果顯示在m RNA水平上,凋亡相關基因Bim和Bax的m RNA水平明顯升高,Sab高劑量組降低更明顯,survivin的m RNA水平明顯下降;Western blotting結果顯示在蛋白水平,Bim、Bax,PUMA表達水平升高,survivin表達下降。免疫組化結果顯示經(jīng)Sab處理后,凋亡相關指標survivin表達水平下降,而Bax表達水平升高。3.PCR結果顯示在m RNA水平上,CD44,ALDH和ABCG2表達水平顯著下降,CD24的m RNA水平未見明顯變化。乳腺癌細胞系干細胞亞群分析發(fā)現(xiàn),相較于乳腺癌敏感細胞,耐藥細胞系MCF-7/A02和CALDOX中CD44+/CD24-及ALDH+細胞的比例明顯增高。給予耐藥細胞系Sab處理后,CD44+/CD24-及ALDH+細胞的比例下降,并呈劑量依賴性。免疫組化結果顯示經(jīng)Sab處理后,干細胞標志物CD44及ALDH表達水平下降,p AKT及p STAT3經(jīng)Sab處理后表達水平下降,即IL-6/STAT3信號轉導通路活性受抑制。4.懸浮細胞球囊培養(yǎng)和軟瓊脂克隆實驗證實耐藥細胞球囊形成能力及體外成瘤能力較敏感細胞更高,Sab對MCF-7/A02和CALDOX細胞系干細胞體外成瘤能力和球囊形成能力均有抑制作用,亦呈劑量依賴性。5.通過Sab聯(lián)合化療藥物在乳腺癌耐藥細胞系中的作用研究中提示,Sab聯(lián)合多柔比星/依托泊苷對乳腺癌耐藥細胞系具有協(xié)同增效作用。結論:1.Sab可有效抑制乳腺癌耐藥細胞生長增殖,促進腫瘤細胞凋亡。2.Sab增加促凋亡蛋白Bax和Bim表達,降低抗凋亡蛋白survivin表達進而實現(xiàn)其促進凋亡影響乳腺癌細胞的多藥耐藥的功能。3.Sab可有效抑制耐藥細胞系中乳腺癌干細胞的比例,從而抑制耐藥細胞的增殖以及成瘤能力。4.Bcl-2家族抑制劑Sab可以克服腫瘤細胞耐藥,與常規(guī)細胞毒性化療藥物聯(lián)合應用具有協(xié)同增效作用。
【圖文】：

圖 1.2 Sab 和 DOX 對乳腺癌敏感和耐藥細胞克隆形成能力的抑制作用1.2.2 Sab 誘導乳腺癌耐藥細胞凋亡首先我們利用Annexin V/PI染色法檢測Sab對乳腺癌耐藥細胞的凋亡誘導作用。結果顯示敏感細胞 MCF-7 和耐藥細胞 MCF-7/A02 在接受相同劑量依托泊苷40μM 處理后，MCF-7 細胞凋亡明顯，凋亡細胞占總細胞數(shù)的 63.3%，而MCF-7/A02 細胞僅占 17.9%；Cal51 和 CALDOX 接受依托泊苷 10μM 處理后凋亡細胞分別為 26.6%和 5.7%（圖 1.3.1）�？梢姡劳胁窜湛梢哉T導敏感乳腺癌細胞凋亡，而對耐藥細胞凋亡誘導作用較低。不同的是 MCF-7 和 MCF-7/A02 細胞給予 Sab 10μM 處理 24 小時后，凋亡細胞比例分別占 25.8%和 18.3%，可見對于敏感及耐藥細胞均具有抑制作用。Cal51 和 CALDOX 接受 Sab 5μM 處理后，凋亡細胞分別占 23.4%和 20.4%�？傊�，Sab 可以誘導乳腺癌敏感和耐藥細胞凋亡，與傳統(tǒng)化療藥物相比，對耐藥細胞較為敏感（圖 1.3.1）。

圖 1.3.1 Sab 及依托泊苷對乳腺癌耐藥細胞凋亡的誘導作用為了進一步驗證 Annexin V/PI 染色法結果，我們在耐藥細胞中進行 caspase3/7 活性和 caspase 9 活性的檢測。結果顯示，給予不同濃度 Sab 處理耐藥細胞MCF-7/A02 和 CALDOX 后，，caspase 3/7 活性和 caspase 9 活性增加，且隨著劑量增加活性增強。caspase 3/7和caspase 9活性檢測進一步驗證了Sab通過caspase途徑誘導乳腺癌耐藥細胞凋亡（圖 1.3.2）。圖 1.3.2 Sab 對乳腺癌耐藥細胞誘導凋亡的 caspase 活性影響1.2.3 Sab 可阻斷凋亡信號通路誘導乳腺癌耐藥細胞凋亡
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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本文編號：2528660