【摘要】：世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)表明,乳腺癌是嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤,平均每8位成年女性中就有一位罹患乳腺癌,乳腺癌的發(fā)病率和致死率在女性惡性腫瘤中始終居首位。2014年全球女性乳腺癌新發(fā)病例和死亡病例分別占女性惡性腫瘤患者的29%和15%。雖然近年來(lái)在乳腺癌的發(fā)病機(jī)理方面已有大量的研究報(bào)道,并且有些靶點(diǎn)也已開(kāi)發(fā)靶向藥物用于臨床治療,但是療效并不樂(lè)觀,轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍然是對(duì)乳腺癌患者的極大威脅。因此亟需進(jìn)一步深入研究和完善乳腺癌發(fā)病的分子機(jī)制,為其診治提供新策略、新思路。微小RNA (microRNA, miRNA, miR)是新發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性表達(dá)的單鏈短序列小RNA,長(zhǎng)度約19-25個(gè)核苷酸序列,不編碼蛋白質(zhì),廣泛存在于真核細(xì)胞中,在進(jìn)化上具有保守性。研究發(fā)現(xiàn)microRNA與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。microRNA的發(fā)現(xiàn)為研究完善乳腺癌的發(fā)病機(jī)制提供了極大的補(bǔ)充,具有廣闊的應(yīng)用前景。本課題檢測(cè)了miR-372在乳腺正常上皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況；成功建立穩(wěn)定高表達(dá)miR-372的乳腺癌細(xì)胞株(MCF7-miR-372);通過(guò)裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)明確了miR-372在乳腺癌細(xì)胞增殖中的作用；并利用生物信息學(xué)方法篩選了miR-372下游的可能靶基因,并進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)p62是miR-372的下游靶標(biāo)基因之一。本課題的研究成果將加深我們對(duì)乳腺癌發(fā)病的分子機(jī)理的了解,為乳腺癌的早期診斷和治療提供新的線索,同時(shí)將可能為相關(guān)的新藥開(kāi)發(fā)提供重要的分子靶點(diǎn)。 1.目的 研究miR-372在乳腺癌中的作用并探討其相關(guān)機(jī)制。 2.材料和方法 2.1應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析乳腺正常上皮來(lái)源的永生化細(xì)胞株MCF.10A和乳腺癌細(xì)胞株MCF-7, T47D, Bcap-37中miR-372的表達(dá)情況。 2.2利用慢病毒載體pLVX-miRNA,構(gòu)建miR-372過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pLVX-miR-372),與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,包裝出高滴度的病毒顆粒并感染MCF-7細(xì)胞,用嘌呤霉素(puromycin)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)miR-372的細(xì)胞株(MCF-7-miR-372). 2.3建立裸鼠皮下移植瘤模型。將BALB/c裸鼠隨機(jī)分為兩組(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組8只),將MCF-7-miR-372細(xì)胞和MCF-7-vector細(xì)胞的細(xì)胞懸液分別接種于兩組裸鼠右腋皮下,從接種后第7天開(kāi)始記錄數(shù)據(jù),每周兩次測(cè)量瘤體大小(最大和最小直徑),動(dòng)態(tài)觀察、測(cè)量并記算腫瘤體積大小及荷瘤鼠體重。在接種后第29天時(shí)用頸椎脫臼法處死裸鼠,剝離移植瘤組織,稱量瘤體重量,繪制生長(zhǎng)曲線。 2.4利用TargetScan, miRanda二個(gè)預(yù)測(cè)軟件和GO功能富集分析方法,綜合分析相關(guān)因素,篩選出miR-372可能的下游靶點(diǎn)p62。利用蛋白免疫印跡(Western Blot實(shí)驗(yàn))檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-372前后p62蛋白水平的改變；利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-372對(duì)p62的靶向調(diào)控作用。 3.結(jié)果 3.1與乳腺正常上皮來(lái)源的永生化細(xì)胞株MCF-10A相比,miR-372在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、T47D、Bcap-37中的表達(dá)均顯著下調(diào)。 3.2成功包裝了miR-372過(guò)表達(dá)慢病毒并篩選建立穩(wěn)定高表達(dá)miR-372的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7-miR-372. 3.3體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明MCF-7-miR-372組(實(shí)驗(yàn)組)的裸鼠體內(nèi)腫瘤體積和腫瘤重量都顯著小于MCF-7-vector組(對(duì)照組)(p0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明過(guò)表達(dá)miR-372能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)增殖能力。 3.4Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MCF-7-miR-372細(xì)胞中的p62蛋白水平顯著低于對(duì)照組細(xì)胞,提示miR-372可能負(fù)向調(diào)控p62的表達(dá)。雙熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果證實(shí)miR-372能通過(guò)與p623-UTR結(jié)合,從而抑制p62的翻譯。以上兩方面的結(jié)果表明,p62很可能是miR-372直接作用的下游靶基因。 4.結(jié)論 4.1miR-372在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)下降,提示miR-372在乳腺癌中可能起到腫瘤抑制因子的作用。 4.2過(guò)表達(dá)miR-372能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的成瘤能力,表明miR-372在乳腺癌中起腫瘤抑制因子的作用。 4.3miR-372可能通過(guò)靶向抑制p62在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平,從而參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖。
【圖文】：

圖1 microRNA生成和作用通路示意圖2002年11月Croce研究小組首次報(bào)道m(xù)icroRNA異常與腫瘤相關(guān)“6,目前越來(lái)越多的證據(jù)顯示microRNA在脾瘤形成的過(guò)程中扮演著重要的角色，其異常的

上海生博基因技術(shù)有限公司提供的pLVX-miRNA載體（圖譜如下圖）統(tǒng)，把構(gòu)建好的miR-372質(zhì)粒（pLVX-miR-372 )和病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)T細(xì)胞包裝病毒，同時(shí)包裝對(duì)照病毒，，測(cè)定滴度后分裝保存于-801冰箱
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Hiroyuki Yamamoto;Yasushi Adachi;Hiroaki Taniguchi;Hiroaki Kunimoto;Katsuhiko Nosho;Hiromu Suzuki;Yasuhisa Shinomura;;Interrelationship between microsatellite instability and microRNA in gastrointestinal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2012年22期

本文編號(hào)：2528630