【摘要】：目的本課題以肝癌細胞株HepG2和原發(fā)性肝癌臨床病理組織標本為研究對象,觀察TLR4(Toll-like receptor 4,TLR4)介導的信號通路對原發(fā)性肝癌中IL-23(interleukin-23,IL-23)和IL-17A表達的影響,分析TLR4、IL-23及IL-17A與原發(fā)性肝癌臨床病理特征的關(guān)系,揭示TLR4可經(jīng)由IL-23/IL-17A炎癥軸在原發(fā)性肝癌的發(fā)生和發(fā)展中起作用,為原發(fā)性肝癌的臨床免疫治療提供理論和實驗依據(jù)。方法(1)應用CCK-8法檢測TLR4的激活劑LPS(Lipopolysaccharides,LPS)與髓樣分化因子-88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)的阻斷劑ST2825對HepG2細胞增殖活性的影響。(2)運用ELISA法檢測LPS和ST2825對HepG2細胞分泌IL-23與VEGF的影響。(3)用RT-qPCR技術(shù)檢測HepG2細胞TLR4、IL-23、IL-17A、IL-6、及NF-κB mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。(4)采用Western-blot法測定HepG2細胞TLR4、IL-23及IL-17A蛋白的表達。(5)收集寧夏醫(yī)科大學附屬醫(yī)院臨床上未經(jīng)化療和放療的肝癌癌標本45例,行臨床病理組織分型和臨床分期,同時取遠端癌旁正常組織20例(均證實無癌細胞)為正常對照,行常規(guī)石蠟包埋、切片,免疫組化法檢測肝癌組織和遠端癌旁組織TLR4、IL-23和IL-17A的表達及與臨床病理的關(guān)系。結(jié)果(1)CCK-8法檢測結(jié)果顯示,與細胞對照組相比較,選用的1 mg/l LPS培養(yǎng)24 h對HepG2細胞無毒且能促進細胞增殖,選用ST2825 40μmol/l的濃度培養(yǎng)8 h對HepG2無毒且則抑制細胞生長。(2)LPS促進了HepG2細胞的IL-23與VEGF的表達量,隨時間的增長表達水平升高,阻斷MyD88后其表達水平下降。(3)LPS促進HepG2細胞株TLR4、IL-23、IL-17A、IL-6、NF-κB mRNA的轉(zhuǎn)錄;阻斷MyD88后則IL-23、IL-17A、IL-6、NF-κB mRNA的轉(zhuǎn)錄下降。(4)LPS促進HepG2細胞株TLR4、IL-23、IL-17A的蛋白表達,阻斷MyD88后IL-23和IL-17A蛋白表達則降低。(5)免疫組化結(jié)果顯示,肝癌組織和癌旁正常組織中均有TLR4、IL-23及IL-17A的表達,但TLR4、IL-23及IL-17A在肝癌組織的蛋白表達陽性率顯著高于遠端癌旁的正常組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);45例肝癌組織中TLR4、IL-23、IL-17A的蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P0.05),而與患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤發(fā)生部位均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論(1)TLR4、IL-23及IL-17A參與原發(fā)性肝癌的發(fā)生與進展。(2)TLR4/MyD88介導的信號轉(zhuǎn)導通路對IL-23/IL-17A炎癥軸具有調(diào)控作用。
【圖文】：

在電子載體 1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Meth體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲佨產(chǎn)物（量與活細胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在 450 nm450），可間接反映活細胞數(shù)量。接種 96 孔板，分為 5 組，進行預處理加 LPS (0 mg/l，0.g/l) 培養(yǎng)不同的時間（6 h，12 h，24 h，36 h）。通過 CC0 nm，OD 值分析結(jié)果如下圖（圖 1），實驗結(jié)果顯示在不同2 細胞的 OD450統(tǒng)計學無差異，而處理 24 h OD450用統(tǒng)計g/l、5 mg/l、10 mg/l LPS 分別兩兩比較無統(tǒng)計學差異，兩比較有差異性統(tǒng)計學意義 P＜0.05。此結(jié)果說明 1 mg有強的增值能力。下一步實驗 LPS 對 HepG2 的處理都是

接種 96 孔板，分為四組進行預處理 1 mg/l LPS 24 小時 μmol/l，，20 μmol/l，40 μmol/）進行培養(yǎng)時間是 4 h，8 h 450 nm，OD 值分析結(jié)果如下圖（圖 2），在 4 h，12 h 檢無差異，而處理 8 h OD450值用統(tǒng)計學多因素方差分析 P對照 10 μmol/l、20 μmol/l ST2825 兩兩比較有統(tǒng)計學差異胞的處理是 40 μmol/l 時間是 8 h。
【學位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2528548