【摘要】：[背景與目的]腫瘤惡性生物學(xué)行為與其特殊的物質(zhì)能量代謝密切相關(guān),異常的物質(zhì)能量代謝已成為腫瘤細(xì)胞新的生物學(xué)特性并越來越受到關(guān)注。鋅-α2-糖蛋白(Zinc-α2-glycoprotein,ZAG)基因定位于染色體7q22.1,其編碼42kDa的分泌性蛋白,體內(nèi)實驗證實ZAG能強(qiáng)烈促進(jìn)脂肪分解,多種腫瘤中ZAG表達(dá)常下調(diào),而脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FASN)與哺乳動物雷帕霉素(Mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路活性常上調(diào),另有報道稱FASN、Akt/mTOR信號通路參與多種腫瘤細(xì)胞的物質(zhì)能量代謝,但三者在腸癌細(xì)胞物質(zhì)能量代謝過程中的相互作用機(jī)理并不清楚。本研究旨在探討ZAG與FASN交互作用對腸癌細(xì)胞惡行生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制。以期進(jìn)一步明確相關(guān)分子在大腸癌發(fā)病過程中的作用,為大腸癌的分子診斷和靶向治療提供實驗依據(jù)。[方法]1. RT-PCR與Western blot檢測腸癌細(xì)胞系LoVo/HT-29/Caco-2/HCT-116中ZAG基因及蛋白的表達(dá),選取ZAG表達(dá)低的細(xì)胞株作為后續(xù)實驗的靶細(xì)胞。2.構(gòu)建ZAG過表達(dá)質(zhì)粒及其空載質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞株,觀察轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR與Western blot檢測轉(zhuǎn)染后ZAG基因及蛋白表達(dá)。3. RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染前后LoVo細(xì)胞FASN、mTOR、Akt等相關(guān)信號通路基因的表達(dá);Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后LoVo細(xì)胞FASN、t-mTOR、p-mTORser2448、t-Akt、p-Aktser473等相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)。4.檢測過表達(dá)ZAG質(zhì)粒及其空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后ATP水平的變化,并檢測各組細(xì)胞上清中乳酸水平改變,研究ZAG對腸癌細(xì)胞能量代謝的影響。5. MTT增殖實驗、克隆形成實驗以及Transwell實驗檢測ZAG過表達(dá)對腸癌細(xì)胞株增殖、侵襲和遷移能力的影響,使用碘化丙啶(Propidiumiodide,PI)標(biāo)記各組靶細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染ZAG前后靶細(xì)胞細(xì)胞周期的變化。6.不同濃度(0.001μM, 0.01μM, 0.1μM, 11μM, 10μM的FANS特異性淺藍(lán)菌素(Cerulenin)作用于腸癌細(xì)胞HT-29和LoVo細(xì)胞株,藥物毒性實驗檢測淺藍(lán)菌素對腸癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(Inhibitory concentration of 50%,IC50)。7. QRT-PCR和Western blot檢測Cerulenin處理組、DMSO對照組和空白組細(xì)胞中ZAG、FASN、t-mTOR、p-mTORser2448、t-Akt、p-Aktser473等相關(guān)分子的表達(dá)。8.使用Cerulenin處理HT-29和LoVo細(xì)胞,檢測處理組和對照組細(xì)胞中ATP水平及培養(yǎng)基中乳酸變化,觀察Cerulenin對各組腸癌細(xì)胞能量代謝的影響。9.細(xì)胞克隆形成實驗、Transwell小室實驗檢測Cerulenin對各組腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測Cerulenin對LoVo和HT-29細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響。[結(jié)果]1. RT-PCR結(jié)果顯示,與HT-29/Caco-2/HCT-116腸癌細(xì)胞相比,LoVo細(xì)胞中ZAG基因相對表達(dá)最低(0.46±0.05) (P0.05),Western blot檢測4株腸癌細(xì)胞中ZAG蛋白的表達(dá),結(jié)果提示LoVo細(xì)胞中ZAG蛋白相對表達(dá)(0.43±0.05)最低(P0.05),因此本章實驗選取LoVo細(xì)胞作為靶細(xì)胞。2.使用pGCMV/EGFP/Neo /ZAG質(zhì)粒及其空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)情況,實驗組與空載質(zhì)粒組均有較高的轉(zhuǎn)染效率,使用抗性基因成功篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,RT-PCR證實轉(zhuǎn)染pGCMV/EGFP/Neo/ZAG質(zhì)粒后的LoVo細(xì)胞ZAG基因相對表達(dá)增加(0.65±0.05)(P0.05),Western blot顯示與其它對照組相比實驗組ZAG蛋白相對表達(dá)增加(0.67±0.06)(P0.05)。空載質(zhì)粒組和空白組ZAG表達(dá)無差異(P0.05)。3. RT-PCR結(jié)果顯示;與空載質(zhì)粒組和空白組相比,轉(zhuǎn)染ZAG質(zhì)粒的LoVo細(xì)胞中FASN基因相對表達(dá)(0.55±0.08)下調(diào)(P0.05),但mTOR基因(0.81±0.06)與Akt基因(0.78±0.06)相對表達(dá)與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異;Western blot結(jié)果顯示,與空載質(zhì)粒組和空白組相比,轉(zhuǎn)染過表達(dá)ZAG質(zhì)粒的LoVo細(xì)胞FASN (0.61±0.06)、p-mTORser2448(0.53±0.08)和 p-Aktser473(0.58±0.10)相對表達(dá)下調(diào)(P0.05),t-mTOR(0.97±0.13)和t-Akt(0.83±0.14)相對表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。4.與空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白組相比,轉(zhuǎn)染過表達(dá)ZAG質(zhì)粒的LoVo細(xì)胞內(nèi)ATP含量(611.23 ± 97.37 mmol/grot)降低,細(xì)胞上清中乳酸的濃度(29.84 ±5.04 mmol/L)也同時降低(P0.05)。5. MTT實驗顯示與空載質(zhì)粒組和空白組相比,過表達(dá)ZAG的LoVo細(xì)胞的增殖能力(0.79±0.08)減弱;克隆形成實驗結(jié)果顯示實驗組LoVo細(xì)胞細(xì)胞克隆形成率降低(4.38%±0.71%); Transwell小室實驗結(jié)果提示轉(zhuǎn)染ZAG過表達(dá)質(zhì)粒的LoVo細(xì)胞穿過半透膜的數(shù)量(64.33±8.02)明顯減少;使用PI標(biāo)記各組細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示實驗組LoVo細(xì)胞G2期的細(xì)胞比例(29.47%±2.03%)增高(P0.05)。6.使用一系列Cerulenin濃度處理HT29和LoVo細(xì)胞48h后,二者增殖率分別是(82.34±5.38%, 74.78 ±9.44%, 66.21 ±4.37%, 60.16 ±9.95%, 38.05 ±8.26 %)和(83.45± 7.86 %, 75.05 ±9.11 %, 63.93 ± 4.48 %, 45.59 ± 11.42 %, 21.68 ± 6.87 %),Cerulenin處理HT29和LoVo細(xì)胞的IC50分別是 1.93μM和0.37μM,使用此Cerulenin濃度和配對的DMSO濃度進(jìn)行本部分后續(xù)實驗。7. RT-PCR結(jié)果顯示,經(jīng)Cerulenin處理后的HT-29和LoVo細(xì)胞株ZAG基因(0.37±0.06和0.29±0.06 )表達(dá)水平較空白組和DMSO組降低(P 0.05),mTOR基因(0.76±0.14和0.85±0.10)和Akt基因(0.64±0.06和0.78±0.08)相對表達(dá)與DMSO組和空白組相比無統(tǒng)計學(xué)差異;Western blot結(jié)果顯示,與空白組和DMSO組相比,經(jīng)Cerulenin處理的HT-29 和 LoVo 細(xì)胞株 FASN 表達(dá)(0.34±0.08 和 0.52±0.04)、ZAG(0.38±0.05 和0.21±0.04)、p-mTORser2448(0.42±0.03和0.44±0.01)和p-Aktser473(0.55±0.10和0.58±0.10)相對表達(dá)降低(P 0.05),但t-mTOR(0.90±0.10和0.88±0.10)和t-Akt相對表達(dá)(0.80±0.16和 0.85±0.11)無統(tǒng)計學(xué)差異(P 0.05)。8.實驗組HT29和LoVo細(xì)胞中ATP的含量(449.60 ± 94.81 mmol/grot 和 528.73 ± 37.43 mmol/grot)較DMSO組和空白組降低(P0.05),同時培養(yǎng)基中的乳酸水平(24.20 ±3.05 mmol/L 和 29.78 ± 2.10 mmol/L)也較DMSO組和空白組降低(P 0.05),DMSO組與空白組未見ATP或乳酸差異。9.實驗組HT29和LoVo細(xì)胞克隆形成率降低(6.36%±1.07%和 11.16%±1.46) (P 0.05);同時FANS的抑制也誘導(dǎo)了HT29和LoVo細(xì)胞侵襲能力(80.33±12.40和96.67±16.27)的降低(P 0.05); Cerulenin誘導(dǎo)HT29和LoVo細(xì)胞凋亡率(37.41%±8.48% 和31.28%±3.98%)增加。[結(jié)論]1. ZAG過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建并成功轉(zhuǎn)染入LoVo細(xì)胞,過表達(dá)ZAG可抑制Akt/mTOR通路活性,進(jìn)而抑制FASN的表達(dá),最終阻滯腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為(細(xì)胞增殖、侵襲能力、凋亡和細(xì)胞周期)及能量代謝。2. FASN的抑制導(dǎo)致Akt/mTOR通路活性降低,進(jìn)一步影響ZAG的表達(dá),最終阻滯腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為(細(xì)胞增殖、侵襲能力、凋亡和細(xì)胞周期)及能量代謝。3. ZAG與FASN交互作用可調(diào)節(jié)腸癌細(xì)胞的能量代謝及其惡行性,且此過程可能由Akt/mTOR信號通路介導(dǎo)。
【圖文】：

圖１靶細(xì)胞的篩選與ＺＡＧ質(zhì)粒表達(dá)效果；（ａ）瓊脂糖凝膠電泳檢測ＰＣＲ擴(kuò)增的ＺＡＧ基因片段，，（ｂ）逡逑四株腸癌細(xì)胞中ＺＡＧ基因的相對表達(dá)，（ｃ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ顯示四株腸癌細(xì)胞中ＺＡＧ蛋白的表達(dá)，逡逑（ｄ）四株腸癌細(xì)胞中ＺＡＧ蛋白的相對表達(dá)，（ｅ）瓊脂糖凝膠電泳檢測轉(zhuǎn)染前后ＬｏＶｏ細(xì)胞中ＺＡＧ逡逑的表達(dá)，（ｆ）過表達(dá)ＺＡＧ質(zhì)粒促進(jìn)ＬｏＶｏ細(xì)胞中ＺＡＧ基因的表達(dá)。＊與對照組和空白組相比，Ｐ＜０．０５。逡逑

相對表達(dá)（０．７７±０．１０）、ｍＴＯＲ基因的相對表達(dá)（０．８５±０．０８）和Ａｋｔ基因的相對表達(dá)逡逑（０．７６士０．０７）與空白組ＦＡＳＮ基因相對表達(dá)（０．７９±０．０７）、ｍＴＯＲ基因的相對表達(dá)逡逑（０．８８±０．０９）和Ａｋｔ基因的相對表達(dá)（０．７７±０．０８）無統(tǒng)計學(xué)差異（＿Ｐ＞０．０５）（圖３ａｂ）。逡逑為進(jìn)一步研究ＬｏＶｏ細(xì)胞中ＺＡＧ表達(dá)對ＦＡＳＮ及Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信號通路活性的影響，我們對逡逑各實驗組相關(guān)靶蛋白進(jìn)行了檢測，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ結(jié)果提示，與空白組和對照組相比經(jīng)ＺＡＧ逡逑表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的ＬｏＶｏ細(xì)胞ＺＡＧ蛋白表達(dá)（０．６７＾０．０６）增高（Ｐ＜０．０５），但ＦＡＳＮ相對表逡逑達(dá)（０．６１±０．０６）也降低，ｔ－ｍＴＯＲ相對表達(dá)（０．９７±０．１３）與ｔ－Ａｋｔ相對表達(dá)（０．８３土０．１４）逡逑１逡逑（ｔ２Ｊｂｐ｜邋＾邐Ａ．，＇務(wù)一開．逡逑＿ｒ邋■N邋＿邋Ｓ逡逑摩■：獲■逡逑％邐ＦＡＳＮ邐ｍＴＯＲ邐ＡＭ；逡逑⑷邐決》邐ｉｉ邋ｓｉａｉｏｔ邋ｇｒｏ＾ｉ邋~|

本文編號：2524064