【摘要】：隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)的飛速進(jìn)步,在僅數(shù)十年中腫瘤學(xué)家在跟腫瘤的斗爭(zhēng)中取得了巨大的進(jìn)展,但腫瘤的耐藥、侵襲和轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)仍然是阻礙臨床治療的巨大的挑戰(zhàn)。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)化療藥物5-氟尿嘧啶處理后存活的慢周期CT26細(xì)胞具有化療耐藥、成瘤性更強(qiáng)等特點(diǎn),可能成為復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的源頭。為了探尋其中的機(jī)制,我們通過(guò)表達(dá)譜芯片發(fā)現(xiàn)了一些表達(dá)顯著改變的基因和信號(hào)通路。在本研究中我們聚焦其中一個(gè)比較特別的基因：顆粒酶M,著重探索其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)和意義。顆粒酶M (granzyme M, GZMM),之前認(rèn)為其限制性表達(dá)在NK細(xì)胞等淋巴細(xì)胞中,與穿孔素等聯(lián)合作用通過(guò)蛋白裂解導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。近年來(lái)對(duì)顆粒酶的研究越來(lái)越深入,最近的證據(jù)顯示顆粒酶的功能非常多樣,從降解細(xì)胞外基質(zhì)到促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生,生長(zhǎng)因子釋放,和直接抗病毒效應(yīng)等等。在本研究中,我們根據(jù)表達(dá)譜芯片中的數(shù)據(jù)第一次驗(yàn)證了GZMM在一系列小鼠和人腫瘤細(xì)胞系中不同水平的表達(dá),而且在人的結(jié)腸癌、乳腺癌和肺腺癌樣本中檢測(cè)到表達(dá)。GZMM在結(jié)腸癌的表達(dá)顯著高于配對(duì)的癌旁的粘膜組織,在發(fā)生轉(zhuǎn)移的原發(fā)結(jié)腸癌中的表達(dá)平均高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤,提示其表達(dá)與轉(zhuǎn)移的聯(lián)系。GZMM在經(jīng)過(guò)化療藥物5-FU處理后的慢周期CT26和4T1細(xì)胞中表達(dá)上升。利用慢病毒轉(zhuǎn)染在體外構(gòu)建敲降GZMM和過(guò)表達(dá)GZMM的細(xì)胞系并證實(shí)。敲降和過(guò)表達(dá)GZMM對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外增殖沒(méi)有顯著影響,但敲降GZMM可顯著降低細(xì)胞的克隆增殖能力,過(guò)表達(dá)GZMM能顯著增強(qiáng)細(xì)胞的克隆增殖能力,體現(xiàn)了GZMM在苛刻的條件下能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖能力。藥物敏感試驗(yàn)顯示敲降GZMM的CT26和LLC對(duì)化療藥物的殺傷耐受性顯著降低,過(guò)表達(dá)GZMM的可增強(qiáng)CT26和4T1對(duì)化療藥物殺傷的耐受能力。Transwell侵襲能力檢測(cè)結(jié)果顯示敲降GZMM的CT26細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比體外侵襲能力顯著降低,而過(guò)表達(dá)GZMM的4T1細(xì)胞的侵襲能力則顯著提高,提示GZMM可增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞因子檢測(cè)顯示敲降GZMM的CT26細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比分泌炎癥因子IL-6和促血管生成的VEGF顯著減少,而過(guò)表達(dá)GZMM的4T1細(xì)胞則能分泌更多的IL-6和VEGF。小鼠體內(nèi)皮下成瘤實(shí)驗(yàn)顯示敲降GZMM的CT26和LLC在小鼠體內(nèi)的腫瘤與對(duì)照相比生長(zhǎng)顯著受抑制,而過(guò)表達(dá)GZMM的CT26則能生成比對(duì)照更大的腫瘤,4T1中過(guò)表達(dá)GZMM能促進(jìn)腫瘤在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移,顯著降低小鼠的生存期,提示了GZMM具有在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的能力。機(jī)制探索顯示5-FU處理后的CT26和4T1細(xì)胞經(jīng)歷了不同程度的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,CT26-sh GZMM與CT26-NC相比顯示出間質(zhì)表型更少,4T1-GZMM比4T1-NC上皮標(biāo)志表達(dá)下降,間質(zhì)表型表達(dá)上升,提示GZMM與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化之間密切的聯(lián)系。另外檢測(cè)信號(hào)通路活化情況發(fā)現(xiàn)抑制GZMM的表達(dá)能抑制STAT3的磷酸化狀態(tài),過(guò)表達(dá)GZMM能促進(jìn)STAT3磷酸化,而AKT和ERK的磷酸化水平?jīng)]有顯著改變,提示GZMM的表達(dá)可能與STAT3的活化相關(guān)。綜上所述,我們的研究證實(shí)了GZMM在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá),在腫瘤細(xì)胞的增殖、耐藥、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要的作用,同時(shí)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和STAT3的活化密切相關(guān),擴(kuò)展了GZMM的生物學(xué)意義,為腫瘤的臨床治療提供新的思路。
【圖文】：

時(shí)也檢測(cè)了邋ｐｅｒｆｏｒｉｎ和ＧＺＭＢ的表達(dá)情況。結(jié)果與在小鼠腫瘤中檢測(cè)到的情況類(lèi)逡逑似，ＧＺＭＭ在這幾種人的腫瘤細(xì)施中都具有民ＮＡ的表達(dá)，，而ｐｅｒｆｏｒｉｎ和ＧＺＭＢ逡逑只在淋己細(xì)胞中表達(dá)（圖５）。至于ＧＺＭＭ在蛋白水平上的表達(dá)，我們采用胞內(nèi)染逡逑色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其在人腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果如圖６顯示，在ＰＣ－３Ｍ、ＨｅｐＧ２逡逑和ＨＴ－２９中ＧＺＭＭ在部分細(xì)胞中呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，在ＰＣ－３中基本無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，值得逡逑注意的是，ＰＣ－３Ｍ是ＰＣ－３的高轉(zhuǎn)移亞系，這個(gè)結(jié)果提示我們ＧＺＭＭ在腫瘤細(xì)胞中逡逑的表達(dá)可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移性相關(guān)。逡逑Ｇｒａｎｚｙｍｓ邋Ｍ邐１９６ｂｐ逡逑ｐｅｉｉｏｒｉｎ邐R%３６口逡逑Ｇｒａｎｚｙｍｅ邋目邐１１邋化ｐ逡逑Ｐ－ａｃｔｉｎ邐２１８ｂｐ逡逑圖５人腫瘤細(xì)胞中ＧＺＭＭ、ＧＺＭＢ和ｐｅｒｆｏｒｉｎ基因表達(dá)情況逡逑利用ＲＴ－ＰＣＲ方法檢測(cè)ＧＺＭＭ、ｐｅｒｆｏｒｉｎ和ＧＺＭＢ在人腫瘤細(xì)胞（前列腺癌ＰＣ－３和逡逑ＰＣ－３Ｍ、肝癌ＨｅｐＧ２和結(jié)腸癌ＨＴ－２９）中的表達(dá)情況。人的外周血淋己細(xì)胞ＰＢＭＣ逡逑作為陽(yáng)巧對(duì)照，目巧ｃｔｉ邋ｏｎ作為內(nèi)參。逡逑５０逡逑

ＧＺＭＭ在這幾種人的腫瘤細(xì)施中都具有民ＮＡ的表達(dá)，而ｐｅｒｆｏｒｉｎ和ＧＺＭＢ逡逑只在淋己細(xì)胞中表達(dá)（圖５）。至于ＧＺＭＭ在蛋白水平上的表達(dá)，我們采用胞內(nèi)染逡逑色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其在人腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果如圖６顯示，在ＰＣ－３Ｍ、ＨｅｐＧ２逡逑和ＨＴ－２９中ＧＺＭＭ在部分細(xì)胞中呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，在ＰＣ－３中基本無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，值得逡逑注意的是，ＰＣ－３Ｍ是ＰＣ－３的高轉(zhuǎn)移亞系，這個(gè)結(jié)果提示我們ＧＺＭＭ在腫瘤細(xì)胞中逡逑的表達(dá)可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移性相關(guān)。逡逑Ｇｒａｎｚｙｍｓ邋Ｍ邐１９６ｂｐ逡逑ｐｅｉｉｏｒｉｎ邐R%３６口逡逑Ｇｒａｎｚｙｍｅ邋目邐１１邋化ｐ逡逑Ｐ－ａｃｔｉｎ邐２１８ｂｐ逡逑圖５人腫瘤細(xì)胞中ＧＺＭＭ、ＧＺＭＢ和ｐｅｒｆｏｒｉｎ基因表達(dá)情況逡逑利用ＲＴ－ＰＣＲ方法檢測(cè)ＧＺＭＭ、ｐｅｒｆｏｒｉｎ和ＧＺＭＢ在人腫瘤細(xì)胞（前列腺癌ＰＣ－３和逡逑ＰＣ－３Ｍ、肝癌ＨｅｐＧ２和結(jié)腸癌ＨＴ－２９）中的表達(dá)情況。人的外周血淋己細(xì)胞ＰＢＭＣ逡逑作為陽(yáng)巧對(duì)照，目巧ｃｔｉ邋ｏｎ作為內(nèi)參。逡逑５０逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R73-3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 孫本路;詹曉東;蔣成義;;淋巴管形成及組織蛋白酶-D的表達(dá)與喉癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J];臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2012年12期

2 Gong-Jun Tan;Zheng-Ke Peng;Jin-Ping Lu;Fa-Qing Tang;;Cathepsins mediate tumor metastasis[J];World Journal of Biological Chemistry;2013年04期

3 Si-Zhao Lu;Duygu Dee Harrison-Findik;;Autophagy and cancer[J];World Journal of Biological Chemistry;2013年03期

本文編號(hào)：2523048