【摘要】：隨著現(xiàn)代醫(yī)學科學的飛速進步,在僅數(shù)十年中腫瘤學家在跟腫瘤的斗爭中取得了巨大的進展,但腫瘤的耐藥、侵襲和轉(zhuǎn)移以及復發(fā)仍然是阻礙臨床治療的巨大的挑戰(zhàn)。本實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過化療藥物5-氟尿嘧啶處理后存活的慢周期CT26細胞具有化療耐藥、成瘤性更強等特點,可能成為復發(fā)和轉(zhuǎn)移的源頭。為了探尋其中的機制,我們通過表達譜芯片發(fā)現(xiàn)了一些表達顯著改變的基因和信號通路。在本研究中我們聚焦其中一個比較特別的基因：顆粒酶M,著重探索其在腫瘤細胞中的表達和意義。顆粒酶M (granzyme M, GZMM),之前認為其限制性表達在NK細胞等淋巴細胞中,與穿孔素等聯(lián)合作用通過蛋白裂解導致細胞凋亡。近年來對顆粒酶的研究越來越深入,最近的證據(jù)顯示顆粒酶的功能非常多樣,從降解細胞外基質(zhì)到促進細胞因子產(chǎn)生,生長因子釋放,和直接抗病毒效應(yīng)等等。在本研究中,我們根據(jù)表達譜芯片中的數(shù)據(jù)第一次驗證了GZMM在一系列小鼠和人腫瘤細胞系中不同水平的表達,而且在人的結(jié)腸癌、乳腺癌和肺腺癌樣本中檢測到表達。GZMM在結(jié)腸癌的表達顯著高于配對的癌旁的粘膜組織,在發(fā)生轉(zhuǎn)移的原發(fā)結(jié)腸癌中的表達平均高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤,提示其表達與轉(zhuǎn)移的聯(lián)系。GZMM在經(jīng)過化療藥物5-FU處理后的慢周期CT26和4T1細胞中表達上升。利用慢病毒轉(zhuǎn)染在體外構(gòu)建敲降GZMM和過表達GZMM的細胞系并證實。敲降和過表達GZMM對腫瘤細胞的體外增殖沒有顯著影響,但敲降GZMM可顯著降低細胞的克隆增殖能力,過表達GZMM能顯著增強細胞的克隆增殖能力,體現(xiàn)了GZMM在苛刻的條件下能夠促進細胞的增殖能力。藥物敏感試驗顯示敲降GZMM的CT26和LLC對化療藥物的殺傷耐受性顯著降低,過表達GZMM的可增強CT26和4T1對化療藥物殺傷的耐受能力。Transwell侵襲能力檢測結(jié)果顯示敲降GZMM的CT26細胞與對照細胞相比體外侵襲能力顯著降低,而過表達GZMM的4T1細胞的侵襲能力則顯著提高,提示GZMM可增強細胞的侵襲能力。細胞因子檢測顯示敲降GZMM的CT26細胞與對照細胞相比分泌炎癥因子IL-6和促血管生成的VEGF顯著減少,而過表達GZMM的4T1細胞則能分泌更多的IL-6和VEGF。小鼠體內(nèi)皮下成瘤實驗顯示敲降GZMM的CT26和LLC在小鼠體內(nèi)的腫瘤與對照相比生長顯著受抑制,而過表達GZMM的CT26則能生成比對照更大的腫瘤,4T1中過表達GZMM能促進腫瘤在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移,顯著降低小鼠的生存期,提示了GZMM具有在體內(nèi)促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移的能力。機制探索顯示5-FU處理后的CT26和4T1細胞經(jīng)歷了不同程度的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,CT26-sh GZMM與CT26-NC相比顯示出間質(zhì)表型更少,4T1-GZMM比4T1-NC上皮標志表達下降,間質(zhì)表型表達上升,提示GZMM與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化之間密切的聯(lián)系。另外檢測信號通路活化情況發(fā)現(xiàn)抑制GZMM的表達能抑制STAT3的磷酸化狀態(tài),過表達GZMM能促進STAT3磷酸化,而AKT和ERK的磷酸化水平?jīng)]有顯著改變,提示GZMM的表達可能與STAT3的活化相關(guān)。綜上所述,我們的研究證實了GZMM在腫瘤細胞中的表達,在腫瘤細胞的增殖、耐藥、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要的作用,同時與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和STAT3的活化密切相關(guān),擴展了GZMM的生物學意義,為腫瘤的臨床治療提供新的思路。
【圖文】：

時也檢測了邋ｐｅｒｆｏｒｉｎ和ＧＺＭＢ的表達情況。結(jié)果與在小鼠腫瘤中檢測到的情況類逡逑似，ＧＺＭＭ在這幾種人的腫瘤細施中都具有民ＮＡ的表達，，而ｐｅｒｆｏｒｉｎ和ＧＺＭＢ逡逑只在淋己細胞中表達（圖５）。至于ＧＺＭＭ在蛋白水平上的表達，我們采用胞內(nèi)染逡逑色，流式細胞儀檢測其在人腫瘤細胞中的表達。結(jié)果如圖６顯示，在ＰＣ－３Ｍ、ＨｅｐＧ２逡逑和ＨＴ－２９中ＧＺＭＭ在部分細胞中呈現(xiàn)陽性表達，在ＰＣ－３中基本無陽性細胞，值得逡逑注意的是，ＰＣ－３Ｍ是ＰＣ－３的高轉(zhuǎn)移亞系，這個結(jié)果提示我們ＧＺＭＭ在腫瘤細胞中逡逑的表達可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移性相關(guān)。逡逑Ｇｒａｎｚｙｍｓ邋Ｍ邐１９６ｂｐ逡逑ｐｅｉｉｏｒｉｎ邐R%３６口逡逑Ｇｒａｎｚｙｍｅ邋目邐１１邋化ｐ逡逑Ｐ－ａｃｔｉｎ邐２１８ｂｐ逡逑圖５人腫瘤細胞中ＧＺＭＭ、ＧＺＭＢ和ｐｅｒｆｏｒｉｎ基因表達情況逡逑利用ＲＴ－ＰＣＲ方法檢測ＧＺＭＭ、ｐｅｒｆｏｒｉｎ和ＧＺＭＢ在人腫瘤細胞（前列腺癌ＰＣ－３和逡逑ＰＣ－３Ｍ、肝癌ＨｅｐＧ２和結(jié)腸癌ＨＴ－２９）中的表達情況。人的外周血淋己細胞ＰＢＭＣ逡逑作為陽巧對照，目巧ｃｔｉ邋ｏｎ作為內(nèi)參。逡逑５０逡逑

ＧＺＭＭ在這幾種人的腫瘤細施中都具有民ＮＡ的表達，而ｐｅｒｆｏｒｉｎ和ＧＺＭＢ逡逑只在淋己細胞中表達（圖５）。至于ＧＺＭＭ在蛋白水平上的表達，我們采用胞內(nèi)染逡逑色，流式細胞儀檢測其在人腫瘤細胞中的表達。結(jié)果如圖６顯示，在ＰＣ－３Ｍ、ＨｅｐＧ２逡逑和ＨＴ－２９中ＧＺＭＭ在部分細胞中呈現(xiàn)陽性表達，在ＰＣ－３中基本無陽性細胞，值得逡逑注意的是，ＰＣ－３Ｍ是ＰＣ－３的高轉(zhuǎn)移亞系，這個結(jié)果提示我們ＧＺＭＭ在腫瘤細胞中逡逑的表達可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移性相關(guān)。逡逑Ｇｒａｎｚｙｍｓ邋Ｍ邐１９６ｂｐ逡逑ｐｅｉｉｏｒｉｎ邐R%３６口逡逑Ｇｒａｎｚｙｍｅ邋目邐１１邋化ｐ逡逑Ｐ－ａｃｔｉｎ邐２１８ｂｐ逡逑圖５人腫瘤細胞中ＧＺＭＭ、ＧＺＭＢ和ｐｅｒｆｏｒｉｎ基因表達情況逡逑利用ＲＴ－ＰＣＲ方法檢測ＧＺＭＭ、ｐｅｒｆｏｒｉｎ和ＧＺＭＢ在人腫瘤細胞（前列腺癌ＰＣ－３和逡逑ＰＣ－３Ｍ、肝癌ＨｅｐＧ２和結(jié)腸癌ＨＴ－２９）中的表達情況。人的外周血淋己細胞ＰＢＭＣ逡逑作為陽巧對照，目巧ｃｔｉ邋ｏｎ作為內(nèi)參。逡逑５０逡逑
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R73-3

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 孫本路;詹曉東;蔣成義;;淋巴管形成及組織蛋白酶-D的表達與喉癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J];臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2012年12期

2 Gong-Jun Tan;Zheng-Ke Peng;Jin-Ping Lu;Fa-Qing Tang;;Cathepsins mediate tumor metastasis[J];World Journal of Biological Chemistry;2013年04期

3 Si-Zhao Lu;Duygu Dee Harrison-Findik;;Autophagy and cancer[J];World Journal of Biological Chemistry;2013年03期

本文編號：2523048