【摘要】：第一部分Chidamide下調(diào)AML SP1/NFκB/DNMT1、FLT3/STAT5表達(dá)及-其DNA去甲基化機(jī)制研究[目的l：研究HDAC抑制劑Chidamide對(duì)AML的抗白血病作用及其DNA去甲基化機(jī)制。[方法]：Chidamide 0, 1μM,3μM處理AML細(xì)胞MV4-11及Kasumi-1后檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制(CCK-8)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及周期阻滯,同時(shí),Western Blot檢測(cè)SP1、NFκB、FLT3、STAT5、p-STAT5和DNMT1蛋白表達(dá)及組蛋白H3、H4乙�；�,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)DNMT1、P15 mRNA表達(dá),Dotblot測(cè)定細(xì)胞基因組DNA甲基化水平。Chidamide在體外對(duì)患者原代細(xì)胞進(jìn)行處理后應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR及Western Blot檢測(cè)DNMT1、P15 mRNA水平及DNMT1蛋白水平的表達(dá)。[結(jié)果l：Chidamide 0、1μM、3μM處理AML細(xì)胞MV4-11及Kasumi-1后,出現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖抑制及細(xì)胞凋亡,呈時(shí)間、濃度依賴性。藥物作用48小時(shí)后,細(xì)胞周期阻滯于GO/G1期。Chidamide可使MV4-11和Kasumi-1組蛋白H3、H4乙�；�,抑制SP1/NFκB/DNMT1、FLT3/STAT5通路蛋白表達(dá),同時(shí)下調(diào)DNMT1及上調(diào)P15mRNA表達(dá)。Chidamide可使MV4-11和Kasumi-1基因組DNA去甲基化。Chidamide在體外處理患者原代細(xì)胞后可以降低DNMT1 mRNA及蛋白的表達(dá),上調(diào)P15基因的表達(dá)。[結(jié)論]：Chidamide通過組蛋白H3、H4乙�；约耙种芐P1/NFκB/DNMT1通路使基因組DNA去甲基化,使AML細(xì)胞抑癌基因激活而發(fā)揮抗白血病作用；Chidamide下調(diào)MV4-11 FLT3/STAT5/p-STAT5通路蛋白表達(dá)。Chidamide對(duì)于AML尤其FLT3/ITD突變陽性的AML將是一個(gè)極有潛力的HDAC抑制劑。第二部分Chidamide對(duì)AML1-ETO陽性急性髓系白血病表觀遺傳學(xué)研究[目的]：研究HDAC抑制劑Chidamide對(duì)AMLl-ETO陽性AML的細(xì)胞和分子作用及其表觀遺傳學(xué)機(jī)制。[方法]：Chidamide 0、1μM,3μM處理AML1-ETO陽性細(xì)胞Kasumi-1、Skno-1和AML1-ETO陰性細(xì)胞U937\Skno-l-si-AE后,檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯。同時(shí),Western Blot檢測(cè)AML1-ETO陽性細(xì)胞Kasumi-1、Skno-1組蛋白H3、H4乙�；�、DNMT1、DNMT3A、c-KIT、AML1-ETO蛋白表達(dá),實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)DNMT3A、DNMT1、P15基因mRNA的表達(dá)。同時(shí)檢測(cè)AML1-ETO陰性細(xì)胞U937 DNMT3A、P15蛋白及基因表達(dá)。DNA dotblot檢測(cè)Chidamide對(duì)AML1-ETO陽性細(xì)胞基因組DNA甲基化影響。將AML1-ETO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T、Scramble和siRNA轉(zhuǎn)染至293T、Kasumi-1和Skno-148小時(shí)后檢測(cè)AML1-ETO和DNMT3A蛋白表達(dá)。共轉(zhuǎn)染PGL3-DNMT3A、PCMV-AML1-ETO、PGL3-Basic于293T、 Kasumi-1 6小時(shí)后加入Chidamide 3μM,于轉(zhuǎn)染后48小時(shí)后熒光素酶活性測(cè)定DNMT3A的啟動(dòng)子區(qū)活性。[結(jié)果]：Chidamide 0, 1μM,3μM處理后,AML1-ETO陽性細(xì)胞Kasumi-1、Skno-1細(xì)胞增殖抑制及細(xì)胞凋亡較AML1-ETO陰性細(xì)胞U937、Skno-1-si-AE明顯增強(qiáng)。藥物作用48小時(shí)后,Kasumi-1、Skno-1的細(xì)胞周期阻滯于GO/G1期。Chidamide可使Skno-1和Kasumi-1組蛋白H3、H4乙�；�,抑制AML1-ETO、c-KIT、DNMT3A. DNMT1蛋白表達(dá),下調(diào)DNMT3A和DNMT1mRNA表達(dá),上調(diào)P15mRNA表達(dá),但Chidamide未降低U937 DNMT3A蛋白及mRNA表達(dá)。Chidamide可使AML1-ETO陽性細(xì)胞基因組DNA去甲基化。在293T、Kasumi-1、Skno-1細(xì)胞中,過表達(dá)和know down AML1-ETO后,DNMT3A表達(dá)相應(yīng)增加及下降。熒光素酶活性測(cè)定顯示Chidamide可下調(diào)AML1-ETO在DNMT3A啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性。[結(jié)論]：作為新一代的HDAC抑制劑,Chidamide可使AML1-ETO陽性細(xì)胞組蛋白乙�；�,并通過下調(diào)DNMT1、DNMT3A基因組DNA去甲基化,上調(diào)抑癌基因表達(dá)從而發(fā)揮其抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡及細(xì)胞周期阻滯等抗白血病作用。Chidamide誘導(dǎo)AML1-ETO陽性細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞凋亡較AML1-ETO陰性細(xì)胞更為敏感。Chidamide通過抑制AML1-ETO表達(dá)進(jìn)而下調(diào)DNMT3A,但不抑制AML1-ETO陰性細(xì)胞DNMT3A的表達(dá),可能使AML1-ETO陽性細(xì)胞對(duì)Chidamide更為敏感、特異。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.71

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本文編號(hào)：2523026