【摘要】：研究背景：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是血液病中最常見的疾病。目前,藥物化療是治療AML的主要方法,大部分患者可以經(jīng)過化療后得到緩解。但是,部分患者在經(jīng)過治療后不能得到完全緩解,另外,完全緩解后的患者中仍有很大部分會復(fù)發(fā),最終導(dǎo)致治療失敗。白血病細(xì)胞的原發(fā)耐藥及復(fù)發(fā)耐藥是治療失敗的主要原因。深入探索白血病細(xì)胞耐藥過程中的分子機(jī)制,提高白血病細(xì)胞對治療藥物的敏感性是目前研究的熱點(diǎn)。SIRT2是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)依賴性的第三類組蛋白去乙�；窼ir2家族成員之一,可通過去乙酰化作用參與細(xì)胞分化、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移、增殖等活動。研究表明SIRT2可參與調(diào)節(jié)AML細(xì)胞的增殖、凋亡和分化活動,但其在AML細(xì)胞多藥耐藥中的作用和機(jī)制尚不明確。目的：在原發(fā)和復(fù)發(fā)AML患者細(xì)胞中篩查SIRT2是否參與AML對藥物的耐受性,并以AML耐藥細(xì)胞株HL60/A及對藥物相對敏感的親代細(xì)胞株HL60為研究對象,研究SIRT2在多藥耐藥中的生物學(xué)作用及其機(jī)制。方法：1、對2013年4月～2014年1月中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院收治的25例兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(children acute lymphoblastic leukemia, children-ALL)患者,20例成人急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)患者,10例原發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocythemia, ET)患者,11例慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)患者,8例真性紅細(xì)胞增多癥(polycythemia vera, PV)患者,11例骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasm, MPN)患者及15例AML患者骨髓標(biāo)本進(jìn)行研究,并收集6例正常供者骨髓標(biāo)本為對照。分離單個核細(xì)胞,應(yīng)用實(shí)時定量PCR方法檢測骨髓單個核細(xì)胞中SIRT2基因的表達(dá)水平；2、對2013年4月～2014年1月本院收治的15例原發(fā)AML患者及10例復(fù)發(fā)AML患者骨髓標(biāo)本進(jìn)行研究,分離單個核細(xì)胞,應(yīng)用實(shí)時定量PCR方法檢測骨髓單個核細(xì)胞中SIRT2基因的表達(dá)水平；3、應(yīng)用實(shí)時定量PCR方法及Western Blot的方法檢測AML耐藥細(xì)胞株HL60/A及對藥物相對敏感的親代細(xì)胞株HL60中的SIRT2的表達(dá)水平；4、利用RNA干擾方法,構(gòu)建靶向SIRT2基因的特異性干擾載體,轉(zhuǎn)染SIRT2高表達(dá)的HL60/A細(xì)胞株,并采用RT-PCR、免疫熒光和Western Blot方法檢測下調(diào)后細(xì)胞內(nèi)SIRT2的表達(dá)變化,篩選獲得SIRT2表達(dá)水平下調(diào)的細(xì)胞(HL60-SIRT2-sh)。采用激光共聚焦顯微鏡檢測阿霉素(doxorubicin, DOX)在細(xì)胞內(nèi)的蓄積,MTT實(shí)驗檢測SIRT2沉默前后HL60/A細(xì)胞分別對藥物柔紅霉素 (daunorubicin, DNR)和阿糖胞苷(arabinocytidine, Ara-C)敏感性的變化,利用Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI雙染及Western Blot方法檢測SIRT2沉默對柔紅霉素和阿糖胞苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力的影響：5、利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建SIRT2的慢病毒表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染SIRT2低表達(dá)的HL60細(xì)胞,使其過表達(dá)SIRT2,采用RT-PCR、免疫熒光和Vestern Blot方法檢測上調(diào)后細(xì)胞內(nèi)SIRT2的表達(dá)變化,篩選獲得SIRT2表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞(HL60-SIRT2)。采用激光共聚焦顯微鏡檢測阿霉素(DOX)在細(xì)胞內(nèi)的蓄積,MTT實(shí)驗檢測過表達(dá)SIRT2前后HL60細(xì)胞對藥物柔紅霉素(DNR)和阿糖胞苷(Ara-C)敏感性的變化,利用Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI雙染及Western Blot方法檢測過表達(dá)SIRT2對柔紅霉素和阿糖胞苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力的影響；6、采用Western Blot方法檢測上述干擾、過表達(dá)SIRT2基因的細(xì)胞中多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRP1)的變化,對ERK1/2、磷酸化ERK1/2表達(dá)的影響以及相關(guān)蛋白P53和BCL-2的表達(dá)變化,進(jìn)一步采用ERK1/2信號通路抑制劑PD98059研究ERK1/2信號通路在SIRT2參與調(diào)控AML多藥耐藥過程中的作用。結(jié)果：1、在多種白血病患者細(xì)胞中SIRT2的表達(dá)水平均明顯高于正常對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；復(fù)發(fā)AML患者與原發(fā)AML患者比較,細(xì)胞中SIRT2的表達(dá)量增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；2、在AML耐藥細(xì)胞株HL60/A中,SIRT2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯高于其親代細(xì)胞系HL60(P0.05)；3、成功構(gòu)建了SIRT2穩(wěn)定干擾的HL60/A細(xì)胞株：HL60-SIRT2-shl及HL60-SIRT2-sh2;激光共聚焦顯微鏡檢測反射紅色熒光的阿霉素(DOX)在細(xì)胞內(nèi)的蓄積,結(jié)果顯示SIRT2表達(dá)下調(diào)使得阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的蓄積量增加；MTT實(shí)驗結(jié)果顯示沉默SIRT2基因后增加了HL60/A細(xì)胞對柔紅霉素和阿糖胞苷藥物的敏感性；凋亡實(shí)驗結(jié)果顯示SIRT2基因沉默的HL60/A細(xì)胞在柔紅霉素、阿糖胞苷藥物分別處理后凋亡細(xì)胞所占比例均比對照組升高,凋亡效應(yīng)蛋白caspase-3、caspase-7、 caspase-9及caspase-PARP的剪切活化形式均較對照組明顯增加,表明SIRT2基因沉默使多藥耐藥細(xì)胞株HL60/A對阿霉素、柔紅霉素及阿糖胞苷的敏感性增強(qiáng)；4、成功構(gòu)建了SIRT2過表達(dá)的HL60細(xì)胞株(HL60-SIRT2);激光共聚焦顯微鏡檢測阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的蓄積,結(jié)果顯示SIRT2的過表達(dá)使得阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的蓄積量減少；MTT實(shí)驗結(jié)果顯示過表達(dá)SIRT2后,HL60細(xì)胞對柔紅霉素和阿糖胞苷藥物的敏感性減弱；凋亡實(shí)驗結(jié)果顯示過表達(dá)SIRT2的HL60細(xì)胞在柔紅霉素、阿糖胞苷藥物分別處理后凋亡細(xì)胞所占比例均較對照組降低,凋亡效應(yīng)蛋白caspase-3、 caspase-7、caspase-9及caspase-PARP的剪切活化形式均較對照組明顯減少,表明SIRT2的過表達(dá)使HL60細(xì)胞對阿霉素、柔紅霉素和阿糖胞苷的敏感性降低；5、檢測SIRT2基因沉默與過表達(dá)細(xì)胞中MRP1的表達(dá),結(jié)果顯示在SIRT2基因沉默的HL60/A細(xì)胞中MRP1的表達(dá)量降低,而在SIRT2基因過表達(dá)的HL60細(xì)胞中MRP1的表達(dá)量增高,表明SIRT2能夠調(diào)節(jié)MRP1的表達(dá)水平；在SIRT2基因沉默的細(xì)胞中ERK1/2及其磷酸化水平、P53和BCL-2的表達(dá)水平均有變化,其中ERK1/2及其磷酸化水平和BCL-2表達(dá)量均降低,P53表達(dá)量增高；而在SIRT2基因過表達(dá)的細(xì)胞中這些蛋白的表達(dá)量或磷酸化水平的變化與SIRT2基因沉默細(xì)胞中的變化相反；提示在AML細(xì)胞中SIRT2表達(dá)量的變化能引起ERK1/2相關(guān)信號通路活性的改變；6、進(jìn)一步采用ERK1/2信號通路抑制劑PD98059研究ERK1/2信號通路在SIRT2參與調(diào)控AML多藥耐藥過程中的作用。結(jié)果顯示,在SIRT2基因沉默的HL60/A細(xì)胞或SIRT2基因過表達(dá)的HL60細(xì)胞中,加入ERK1/2信號通路抑制劑PD98059之后,均能夠參與由SIRT2表達(dá)量變化所應(yīng)起的相應(yīng)改變,提示SIRT2通過調(diào)節(jié)ERK1/2信號通路的活性影響AML多藥耐藥。結(jié)論：1、在兒童ALL、成人ALL、ET、CML、PV、MPN及AML等血液病患者骨髓中存在SIRT2高表達(dá)的現(xiàn)象,AML中復(fù)發(fā)患者骨髓細(xì)胞中SIRT2的表達(dá)量高于原發(fā)患者。在AML耐藥細(xì)胞株HL60/A中,SIRT2基因的表達(dá)量明顯高于對藥物敏感的親代細(xì)胞HL60。上述研究結(jié)果首次報道SIRT2在多種血液病中的表達(dá)情況,提不SIRT2可能參與急性髓系白血病多藥耐藥的過程。2、SIRT2的表達(dá)能夠正調(diào)控AML細(xì)胞對阿霉素、柔紅霉素和阿糖胞苷的耐藥水平,在SIRT2高表達(dá)的HL60/A細(xì)胞中下調(diào)SIRT2的表達(dá)能夠減弱HL60/A細(xì)胞對柔紅霉素等藥物的耐藥能力,而在SIRT2相對低表達(dá)的HL60細(xì)胞中過表達(dá)SIRT2則能夠增加HL60細(xì)胞對阿霉素、柔紅霉素和阿糖胞苷的耐藥能力,以上研究結(jié)果證實(shí)了SIRT2的表達(dá)水平能夠調(diào)節(jié)AML細(xì)胞對阿霉素、柔紅霉素等藥物的耐藥能力。此外,研究還揭示ERK1/2信號通路介導(dǎo)了SIRT2在AML細(xì)胞多藥耐藥過程中的調(diào)節(jié)作用。研究為探索SIRT2在一些血液病發(fā)生發(fā)展過程中的作用和進(jìn)一步闡明AML細(xì)胞的多藥耐藥機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

代表與正常對照組相比，，尸＜0．0５，代表與正常對照照組相比，尸＜０．００１。逡逑ｅ邋ｍ民ＮＡ邋ｅｘｐ化ｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＳＩＲＴ２邋ｉｎ邋ｂｏｎｅ邋ｍａｒｒｏｗ邋ｍｏｎｏｆｆｅｒｅｎｔ邋ｌｅｕｋｅｍｉａ邋ｗａｓ邋ｄｅｔ；ｅｃｌ；ｅｄ邋ｂｙ邋ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅ邋ｑｕａｎｔｉｌ；ａｔｉｖｅ邋Ｐｅａｎ±ＳＤ邋ｏｆ邋ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ邋ｉｎ邋ａｎ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．邋＊尸＜ｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑ＮＡ在原發(fā)性和復(fù)發(fā)性ＡＭＬ患者骨髓單個核細(xì)胞中液病中的xO究僅有關(guān)于ＳＩＲＴ２參與調(diào)節(jié)急性髓系白早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞分化的報道。在己有的報道量隨著病人病情的加重而增多，然而針對這一現(xiàn)象并提示我們ＳＩＲＩ７可能參與調(diào)節(jié)ＡＭＬ細(xì)胞的多藥耐原發(fā)性ＡＭＬ患者的骨髓標(biāo)本和１０例復(fù)發(fā)性ＡＭＬ患單個核細(xì)胞，采用實(shí)時定量ＰＣＲ方法統(tǒng)計ＳＩＲＴ２邋ｍＳＩＲＴ２在復(fù)發(fā)性ＡＭＬ患者骨髓單個核中的表達(dá)量確異具有顯著性意義ＣＰ＜０．００１）。逡逑逡逑

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北扣協(xié)和醫(yī)學(xué)院辟±研巧化學(xué)位論文ｅｌａｔｉｖｅ邋ｍ民ＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＳＩＲＴ２邋ｉ打邋ｂｏｎｅ邋ｍａｒｒｏｗ邋ｍｏ打０打ｕｃｎｏｓｅｄ邋ＡＭＬ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ａ打ｄ邋ｒｄａｐｓｅ邋ＡＭＬ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｃｋｄ邋ＰＣ民．Ｅａｃｈ邋ｖａｌｕｅ邋ｉｎｄｉｃａｋｄ邋ｔｈｅ邋ｍｅａｎｉＳＤ邋ｏｆ邋ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ邋ｉｎ邋ａｎr>尸＜０．００１，ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗ地邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑在ＡＭＬ細(xì)胞系中的表達(dá)逡逑胞和ＨＬ６０／Ａ細(xì)胞中Ｓ化Ｔ２ｍ民ＮＡ水平的表達(dá)逡逑示ＳＩＲＴ２可能參與ＡＭＬ的多藥耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，為了進(jìn)一藥耐藥現(xiàn)象中的作用及其可能的作用機(jī)制，我們選取了對藥胞系ＨＬ６０和相應(yīng)的具有一定耐藥性的ＨＬ６０／Ａ細(xì)胞株進(jìn)行量ＰＣＲ方法檢測ＳＩＲＴ２邋ｍＲＮＡ在ＨＬ６０細(xì)胞和ＨＬ６０／Ａ細(xì)胞明ＳＩＲＴ２在耐藥細(xì)胞株化６０／Ａ中的表達(dá)量高于化６０細(xì)胞（b6＜0．0１）。逡逑＜逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.71

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本文編號：2521407