【摘要】：人γδT細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞中的一個(gè)特殊亞群,具有天然免疫細(xì)胞的諸多特征,是聯(lián)系固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的橋梁,在機(jī)體免疫監(jiān)視和抗腫瘤免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。γδT細(xì)胞因其主要組織相容性復(fù)合物(Major histocompatibility complex,MHC)非限制性的、廣譜的腫瘤抗原識(shí)別模式、快速活化的效應(yīng)機(jī)制、強(qiáng)大的細(xì)胞毒作用和多種抗腫瘤效應(yīng)性細(xì)胞因子的分泌能力,在腫瘤的免疫細(xì)胞治療中備受重視。γδT細(xì)胞可直接識(shí)別多種抗原分子,研究最多的是小分子磷酸鹽抗原,基于磷酸化抗原擴(kuò)增Vγ9Vδ2T細(xì)胞的過(guò)繼細(xì)胞治療早已進(jìn)入臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)。此外,γδT細(xì)胞還可識(shí)別一些應(yīng)激條件誘導(dǎo)的、在細(xì)胞表面異位表達(dá)的蛋白類配體。本課題組前期研究成果表明,人MutS同源蛋白2(Human MutS homologue 2,hMSH2)是γδT細(xì)胞識(shí)別的腫瘤相關(guān)蛋白類抗原。hMSH2分子是DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的一個(gè)重要成員,主要在細(xì)胞質(zhì)中合成,與系統(tǒng)其他成員hMSH3或hMSH6分子形成異源二聚體進(jìn)入細(xì)胞核中,參與損傷或錯(cuò)配的DNA的修復(fù)過(guò)程。在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,均可以檢測(cè)到hMSH2基因突變或蛋白功能異常。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中采用基于T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)δ 鏈的互補(bǔ)決定區(qū) 3(Complementary determining region 3,CDR3)結(jié)合特性的篩選策略,篩選到hMSH2分子是γδT細(xì)胞識(shí)別的腫瘤相關(guān)配體。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),hMSH2分子在多種腫瘤細(xì)胞膜表面呈廣泛的、不同水平的異位表達(dá)。除了腫瘤之外,在病毒感染及氧化應(yīng)激的情況下,hMSH2分子也能異位表達(dá)于細(xì)胞膜表面。膜異位表達(dá)的hMSH2分子被γδT細(xì)胞受體(γδTcellreceptor,TCRyδ)和NK細(xì)胞受體成員2D(Natural killer group 2 member D,NKG2D)雙重識(shí)別后,參與介導(dǎo)γδT細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷或清除作用。但是,目前異位表達(dá)的hMSH2分子介導(dǎo)γδT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制仍不清楚,澄清hMSH2分子介導(dǎo)γδT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制,有助于進(jìn)一步揭示γδT細(xì)胞在腫瘤免疫監(jiān)視及抗腫瘤免疫中的重要作用。另外,研究hMSH2分子在促進(jìn)γδT細(xì)胞細(xì)胞毒活性方面的效應(yīng),對(duì)于優(yōu)化基于γδT細(xì)胞的腫瘤過(guò)繼免疫治療策略具有重要意義。本研究通過(guò)構(gòu)建hMSH2分子過(guò)表達(dá)的肺癌細(xì)胞模型,探索膜表面異位表達(dá)的hMSH2分子介導(dǎo)γδT細(xì)胞殺傷肺癌細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制,并研究hMSH2分子在促進(jìn)γδT細(xì)胞的細(xì)胞毒活性方面的效應(yīng)。首先,我們檢測(cè)了 4種常用的人肺癌細(xì)胞系(NCI-H520,GLC-82,NCI-H1703 及 NCI-H446)及人胚肺成纖維細(xì)胞 MRC-5 細(xì)胞表面膜hMSH2分子的異位表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同肺癌細(xì)胞系膜表面hMSH2的表達(dá)情況差異較大,從中選擇了細(xì)胞膜表面hMSH2分子低表達(dá)的NCI-H520細(xì)胞作為構(gòu)建過(guò)表達(dá)hMSH2分子的肺癌細(xì)胞模型。利用構(gòu)建的重組表達(dá)載體cFugw-hMSH2轉(zhuǎn)染NCI-H520細(xì)胞,瞬時(shí)表達(dá)hMSH2-EGFP融合蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染后NCI-H520細(xì)胞膜表面的hMSH2分子水平顯著上調(diào),陽(yáng)性細(xì)胞比例從原先的12.67±0.80%升高到62.53±8.22%。體外細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,hMSH2分子在NCI-H520細(xì)胞細(xì)胞膜異位表達(dá)水平的升高能有效增強(qiáng)γδT細(xì)胞對(duì)其的細(xì)胞毒活性。在檢測(cè)對(duì)殺傷過(guò)程中γδT細(xì)胞的活化及細(xì)胞毒相關(guān)效應(yīng)分子的水平時(shí)發(fā)現(xiàn),在與過(guò)表達(dá)hMSH2的NCI-H520細(xì)胞相互作用后,γδT細(xì)胞活化相關(guān)分子CD69和CD107a的表達(dá)水平顯著升高,并分泌更多的抗腫瘤細(xì)胞因子γ-干擾素(IFN-γ)與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。這一結(jié)果提示,hMSH2分子可能是通過(guò)促進(jìn)γδT細(xì)胞的活化、脫顆粒作用及抗腫瘤細(xì)胞因子IFN-γ與TNF-α的分泌來(lái)增強(qiáng)γδT細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞NCI-H520的體外細(xì)胞毒活性。另外,我們還發(fā)現(xiàn),經(jīng)小分子磷酸鹽抗原唑來(lái)膦酸(Zoledronicacid,ZOL)處理后,,γδT細(xì)胞對(duì)NCI-H520細(xì)胞的殺傷活性增加,并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性;同時(shí),在相同條件的唑來(lái)膦酸預(yù)處理組中,γδT細(xì)胞對(duì)hMSH2分子膜異位表達(dá)上調(diào)的NCI-H520細(xì)胞的殺傷效率明顯高于對(duì)野生型NCI-H520細(xì)胞。由此可見(jiàn),hMSH2分子在促進(jìn)γδT細(xì)胞體外殺傷肺癌細(xì)胞系NCI-H520細(xì)胞的活性方面,與唑來(lái)膦酸存在協(xié)同效應(yīng),提示二者能協(xié)同用于抗腫瘤免疫治療。綜上,本研究得出以下主要結(jié)論:1、細(xì)胞膜異位表達(dá)的hMSH2分子參與介導(dǎo)γδT細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,其膜異位水平與γδT細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用成正相關(guān);2、膜異位hMSH2分子介導(dǎo)γδT細(xì)胞殺傷肺癌細(xì)胞的機(jī)制可能與促進(jìn)γδT細(xì)胞活化及分泌抗腫瘤細(xì)胞因子IFN-y與TNF-α有關(guān);3、膜異位hMSH2分子在促進(jìn)γδT細(xì)胞體外殺傷肺癌細(xì)胞的過(guò)程中與磷酸化抗原存在協(xié)同作用。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2521341