【摘要】：結(jié)直腸癌(Colorectal cancer, CRC)是當(dāng)代常見消化道惡性腫瘤之一。每年全球有約120萬名患者被確診為結(jié)直腸癌,而有超過60萬名患者直接或間接死于結(jié)直腸癌。在我國,結(jié)直腸癌的發(fā)病率居常見腫瘤的第四位僅次于肺癌、胃癌及肝癌,也是我國腫瘤發(fā)病率上升最快的腫瘤之一。由于結(jié)直腸癌發(fā)生機制尚不完全明確,故在結(jié)腸癌的診治方面仍存在困難,發(fā)病率、死亡率居高不下。目前,手術(shù)治療是結(jié)直腸癌最有效的治療方法,非手術(shù)治療的方法主要有化療、放療、生物治療以及分子靶向治療。目前提倡個體化治療,若無法手術(shù)治療,則需行化療、放療。結(jié)直腸癌的疾病分期是最重要的預(yù)后因素。在我國,由于大部分患者被確診時己屬中晚期,術(shù)后超過1/3的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,嚴重影響患者的生活質(zhì)量、縮短生存期。因此高效篩查、早期診斷和復(fù)發(fā)的早期檢測是提高結(jié)直腸癌的療效和預(yù)后的關(guān)鍵,對提高患者生活質(zhì)量、減輕痛苦,延長生命具有重要意義。 研究顯示,結(jié)直腸癌如能早期診斷、早期治療是有機會治愈的。腫瘤標志物,又稱腫瘤標記物(tumor marker,TM),是指特征性存在于惡性腫瘤細胞中,或由惡性腫瘤細胞異常產(chǎn)生的物質(zhì),或是宿主對腫瘤的刺激反應(yīng)而產(chǎn)生的物質(zhì)。腫瘤患者的組織、體液和排泄物中都有腫瘤標志物的存在。檢測它們的存在或量變可以提示腫瘤的性質(zhì).并能反映腫瘤發(fā)生、發(fā)展,了解腫瘤的組織發(fā)生、發(fā)展、細胞分化程度及細胞的功能,協(xié)助腫瘤的診斷、分類分型、判斷預(yù)后以及指導(dǎo)下一步治療。腫瘤標志物是目前診斷結(jié)直腸癌的主要輔助手段之一。目前普遍使用的結(jié)直腸癌血清學(xué)診斷標志物是CEA、CA19-9、CA724、 CA125、CA242、CA50,作為目前廣泛應(yīng)用的血清學(xué)早期診斷標記物。其靈敏度及特異度都不高。由于腫瘤基因的復(fù)雜性,要發(fā)現(xiàn)一個靈敏度和特異性的均較高的腫瘤標志物極其困難。醫(yī)學(xué)科研人員正在積極努力尋找即具有高度靈敏度、又具有高度特異性的腫瘤標記物來協(xié)助診斷結(jié)直腸癌,這是具有重要意義的研究。 在疾病研究中,比較蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)揮著重要的作用,它首先檢測出一種腫瘤組織的全部蛋白質(zhì),并通過對疾病組及對照組的比較,發(fā)現(xiàn)疾病特異蛋白組,通過對差異蛋白質(zhì)組學(xué)的分析,可以發(fā)現(xiàn)靈敏度較高和特異性較強的腫瘤標志物,有助于惡性腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早期治療。并對疾病發(fā)病機制、診斷、治療研究和新藥開發(fā)有重要意義。 本研究通過采用二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),對結(jié)直腸癌及癌旁組織蛋白進行分析鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有24個差異蛋白。其中上調(diào)蛋白15個,下調(diào)蛋白9個。此結(jié)果與本實驗室前期的試驗結(jié)果一致。本實驗室將對這24個差異蛋白逐一進行驗證,此次研究只對原肌球蛋白4(Tropomyosin4, TPM4)蛋白進行驗證。 原肌球蛋白(TPM)是細肌絲中與肌動蛋白的結(jié)合蛋白,長為41nm,分子量為2×35KPa,由平行的兩條多肽鏈組成α螺旋構(gòu)型,每條TPM4都是首尾相連接而形成一條連續(xù)不間斷的鏈同肌動蛋白在細肌絲結(jié)合。原肌球蛋白是是調(diào)節(jié)蛋白,它在肌肉收縮過程中起著很重要的作用,以大量異構(gòu)體形式存在于各種真核細胞中。哺乳動物中的4個TPM基因已被確認,即TPM1、TPM2、TPM3、TPM4,至少可表達出20種TPM異構(gòu)體。既往研究顯示,不同的TPM基因突變分別可引起不同的疾病。目前對原肌球蛋白4(TPM4)的研究較少,主要集中在腫瘤與肌肉相關(guān)疾病。腫瘤方面主要局限在與乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究及膀胱癌的相關(guān)性研究。TPM4在結(jié)直腸癌中表達、與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究鮮有報道。我們擬應(yīng)用二維色譜、質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、免疫組織化學(xué),實時定量熒光PCR (Real-Time PCR)和RNAi的方法,來探討TPM4的表達變化與結(jié)直腸癌發(fā)病之間的關(guān)系。 第一部分：應(yīng)用二維色譜、質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對結(jié)直腸癌與癌旁組織進行差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究 方法： 1、收集23例TMN分期為Ⅲ期的結(jié)直腸癌病理分型為腺癌患者的癌組織及癌旁組織標本。 2、標本總蛋白提取,蛋白濃度分析。 3、制備標本蛋白水解多肽混合物。 4、二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析,數(shù)據(jù)庫檢索。 5、Western blot蛋白質(zhì)免疫印跡實驗。 結(jié)果： 1、通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集、整理,癌組織中獲得846個蛋白的鑒定資料,癌旁組織中獲得535個蛋白質(zhì)的鑒定資料。 2、通過差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)顯著差異蛋白24個,在腫瘤組織中15個蛋白上調(diào)表達,9個蛋白下調(diào)表達。 3、Western blot結(jié)果顯示TPM4蛋白在癌組織中表達明顯高于癌旁組織。 小結(jié)： 1、成功應(yīng)用二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)完成結(jié)直腸癌組織及癌旁組織蛋白組數(shù)據(jù)鑒定。 2、通過差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)顯著差異蛋白24個,其中上調(diào)蛋白15個下調(diào)蛋白9個。其中TPM4蛋白經(jīng)Western blot實驗顯示在癌組織中表達明顯高于癌旁組織。 第二部分結(jié)直腸癌組織中TPM4水平表達及臨床意義 方法： 1、臨床資料收集。 2、通過免疫組化方法測定結(jié)直腸癌腫瘤組織中TPM4蛋白表達。 結(jié)果： 1、結(jié)直腸癌腫瘤組織中TPM4表達水平顯著高于癌旁組織。 2、結(jié)直腸癌TNM分期中,TPM4在Ⅰ期和Ⅱ期癌組織中與Ⅲ期和Ⅳ期表達水平無顯著性差異(p0.05)； 3、TPM4在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中的表達水平無顯著性差異(p0.05)； 4、TPM4在伴遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織與無遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中的表達水平無顯著性差異(p0.05)； 5、低分化結(jié)直腸癌組織中TPM4表達水平顯著高于中分化、高分化結(jié)直腸癌(p0.01)。 6、TPM4在結(jié)腸癌組織及直腸癌組織中的表達水平無顯著性差異(p0.05); 7、TPM4在結(jié)直腸癌組織中表達與腫瘤大小無顯著性關(guān)聯(lián)(p0.05)。 小結(jié)： 1、結(jié)直腸癌腫瘤組織中TPM4表達水平顯著升高。 2、結(jié)直腸癌組織中TPM4蛋白表達水平與腫瘤分化程度有關(guān),與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、位置、性別、年齡無關(guān)。 第三部分：結(jié)直腸癌細胞系的選擇、表達載體的構(gòu)建及鑒定 方法： 1、TPM4蛋白在不同結(jié)直腸癌細胞系及正常結(jié)腸細胞系中的表達。 2、TPM4siRNA表達載體的構(gòu)建和質(zhì)粒擴增。 3、TPM4siRNA載體轉(zhuǎn)染效率測定。 結(jié)果： 1、SW480細胞株中TPM4蛋白表達量最高。 2、成功構(gòu)建的TPM4siRNA表達載體,擴增質(zhì)粒濃度正常。 3、TPM4siRNA載體的轉(zhuǎn)染效率符合要求。 小結(jié)： 1、成功從結(jié)直腸癌細胞株中篩選出TPM4高表達的SW480細胞株。 2、本部分實驗所需TPM4siRNA載體構(gòu)建由santa cruz公司完成,成功利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒TPM4siRNA轉(zhuǎn)染到結(jié)直腸癌細胞SW480,熒光顯微鏡觀察,構(gòu)建的TPM siRNA表達載體能夠高效轉(zhuǎn)染SW480細胞。 第四部分：TPM4siRNA轉(zhuǎn)染對人結(jié)腸癌細胞生物學(xué)行為的影響方法： 1、TPM4siRNA對SW480細胞TPM4mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。 2、CCK-8檢測TPM4siRNA載體轉(zhuǎn)染后對SW480細胞活性的影響。 3、TPM4siRNA載體轉(zhuǎn)染后,SW480細胞光鏡下形態(tài)改變及電鏡下細胞亞顯微結(jié)構(gòu)的改變。 4、TPM4siRNA載體轉(zhuǎn)染后對SW480細胞凋亡的影響。 結(jié)果： 1、TPM4siRNA轉(zhuǎn)染后SW480中TPM4mRNA表達量明顯下降。 2、在SW480細胞中轉(zhuǎn)染TPM4siRNA載體后,對細胞會生長抑制不明顯。從時間梯度圖來看,在轉(zhuǎn)染TPM4siRNA載體24h后,開始對細胞生長有明顯的抑制作用,48h作用更為明顯些。 3、TPM4siRNA轉(zhuǎn)染后SW480細胞的亞細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。 4、TPM4siRNA轉(zhuǎn)染后SW480細胞凋亡指數(shù)明顯升高。 小結(jié)： 1、TPM4siRNA轉(zhuǎn)染能有效沉默TPM4mRNA的表達。 2、干擾SW480細胞TPM4的表達能有效抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖。 3、干擾SW480細胞TPM4的表達能改變結(jié)直腸癌細胞的亞結(jié)構(gòu)。 4、干擾SW480細胞TPM4的表達可有效促進結(jié)直腸癌細胞的凋亡 結(jié)論： 1、本課題成功建立了TMN分期為Ⅲ期結(jié)直腸癌組織及癌旁組織的差異蛋白質(zhì)譜,其中差異蛋白24個,上調(diào)蛋白15個,下調(diào)蛋白9個。TPM4蛋白經(jīng)蛋白印跡實驗證實在癌組織中表達明顯高于癌旁組織。 2、通過免疫組化測定組織中TPM4的含量發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌腫瘤組織中TPM4水平顯著高于癌旁組織,且其表達水平與腫瘤的分化程度有關(guān)。 3、成功構(gòu)建了沉默TPM4基因的表達載體,并成功、高效轉(zhuǎn)染SW480細胞。 4、TPM4siRNA干擾SW480細胞后其生物學(xué)行為發(fā)生了明顯改變：SW480細胞中TPM4mRNA的表達減少；SW480細胞增殖受到抑制,凋亡增強。
【圖文】：

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文 2.5 Western blot蛋白質(zhì)免疫印跡實驗我們應(yīng)用二維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析，對比結(jié)直腸癌組織與癌旁組織的蛋白分析數(shù)據(jù)，共鑒定出了有顯著差異的蛋白共24個，其中在腫瘤組織中9個蛋白下調(diào)表達，15個蛋白上調(diào)表達。我們應(yīng)用Western blot蛋白質(zhì)印跡實驗檢測上調(diào)蛋白TPM4在結(jié)直腸癌組織中的表達。結(jié)果可見TPM4蛋白在癌組織中表達明顯高于癌旁組織，兩者具有統(tǒng)計學(xué)差異，進一步驗證了二維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用實驗得出的TPM4蛋白在結(jié)直腸癌腫瘤組織與癌旁組織表達異常這一實驗結(jié)果的準確性，，詳見圖1.6，表1.2P (癌旁組織） C (癌組織）

圖2.1 TPM4在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達及分布A:癌旁正常組織TPM4陰性表達； B:癌旁正常組織TPM4陽性表達C:結(jié)直腸癌組織TPM4陰性表達； D:結(jié)直腸組織癌TPM4陽'If表達*在30例結(jié)直腸癌組織標本中，11例TPM4呈陰性表達，19例TPM4呈陽性表達，TPM4的陽性表達率為63.3% (19/30);在癌旁組織中，23例TPM4呈陰性表達，7例TPM4呈陽性表達，TPM4的陽性表達率為23.3% (7/30)。結(jié)直腸癌組織與癌旁?V組織相比較，TPM4的陽性表達率具有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)，詳見表2.4，圖2.2。28
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 王鳳瑋;溫玲;朱思偉;姚嬙;蔡玉梅;馬剛;;結(jié)直腸癌組織中突變型Axin2對Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的調(diào)控及其機制[J];癌癥;2007年10期

2 楊雪琴;仲召陽;王東;王閣;楊鎮(zhèn)洲;李增鵬;楊宇馨;沈奕播;王正波;;C-12多腫瘤標志物蛋白芯片監(jiān)測胃腸道腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的臨床評價[J];重慶醫(yī)學(xué);2010年04期

3 張艷飛;劉莉;丁彥青;;具有肝轉(zhuǎn)移傾向的結(jié)腸癌細胞亞系的篩選與鑒定[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2007年02期

4 李寧;萬文婷;金林紅;;CCK-8法和MTT法檢測人前列腺癌PC3細胞活性的最佳條件比較研究[J];貴州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2009年03期

5 董冬梅;田艷平;王延春;;CEA、CA19-9和CA72-4的檢測對胃腸道腫瘤的診斷價值[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2006年02期

6 張華寧;高雪芹;;結(jié)直腸癌相關(guān)血清腫瘤標志物的研究進展[J];實用腫瘤雜志;2006年06期

本文編號：2520484