【摘要】：目的:肝癌的惡性程度高,預(yù)后差,目前尚無令人滿意的的治療手段。肝癌病因未明,但可以肯定的是其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因、多步驟的復(fù)雜過程。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,如RNA干擾技術(shù),基因編輯技術(shù)等,使從基因水平治療肝癌成為可能。因此,找到在肝癌的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用的靶基因,通過針對(duì)性地修復(fù)、置換致病基因或糾正異常基因的表達(dá)調(diào)控,可以達(dá)到對(duì)肝癌的治療作用。肌球蛋白VI(MY06)是其家族中唯一一個(gè)向微絲負(fù)極移動(dòng)的蛋白,能水解ATP酶產(chǎn)生能量推動(dòng)肌動(dòng)蛋白絲的運(yùn)動(dòng),是細(xì)胞的馬達(dá)蛋白,能為細(xì)胞的遷移提供動(dòng)力,參與吞飲或吞噬泡的運(yùn)輸,負(fù)責(zé)將高爾基體的分泌泡運(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)適當(dāng)?shù)奈恢?故有動(dòng)力馬達(dá)之美稱。有報(bào)道稱MY06在卵巢癌、前列腺癌及腎癌等惡性腫瘤中高表達(dá),而且抑制MY06的表達(dá)能有效減少腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明MY06在肝癌組織中高表達(dá),提示MY06在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中可能扮演著重要角色。本次實(shí)驗(yàn),我們希望通過增加樣本量,進(jìn)一步觀察MY06在肝癌組織中的蛋白表達(dá)情況,明確MY06在肝癌增殖及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用,并初步探討其可能的內(nèi)在機(jī)制,為肝癌的靶向基因治療提供理論依據(jù)。方法:我們的研究?jī)?nèi)容分為三個(gè)部分。1、通過免疫組化的方法,對(duì)比肝癌組織及正常肝組織中MY06的表達(dá)情況,明確MY06與肝癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。2、進(jìn)一步明確干擾MYO6表達(dá)在肝癌細(xì)胞增殖中的作用并探討其機(jī)制。2.1我們采用慢病毒(LV-MYO6 shRNA-GFP)感染篩選出的HepG2及SMMC7721肝癌細(xì)胞,通過熒光顯微鏡檢測(cè)GFP綠色熒光,觀察兩種肝癌細(xì)胞的慢病毒感染效率,為進(jìn)一步確定MYO6的干擾情況,我們通過real-time PCR及Western blot分別檢測(cè)慢病毒感染HepG2及SMMC7721后MYO6 mRNA及蛋白表達(dá)水平。2.2我們通過MTT實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和Brdu摻入實(shí)驗(yàn)確定干擾MY06后肝癌細(xì)胞的增殖情況。2.3分別觀察了干擾MY06表達(dá)后肝癌細(xì)胞的凋亡、自噬及細(xì)胞周期的改變。具體為:通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)干擾myo6表達(dá)后hepg2肝癌細(xì)胞凋亡水平的變化;通過westernblot及細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)干擾my06表達(dá)對(duì)細(xì)胞自噬的影響;通過流式細(xì)胞術(shù)分析干擾my06表達(dá)后hepg2細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。2.4我們采用細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路檢測(cè)試劑盒結(jié)合westernblot技術(shù)檢測(cè)所涉及凋亡、自噬和細(xì)胞周期改變信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白,初步探討其發(fā)生機(jī)制及信號(hào)通路。3、我們采用transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力并通過westernblot技術(shù)檢測(cè)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,從而研究了干擾my06表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及其機(jī)制。結(jié)果:1、通過免疫組化得出結(jié)果:與正常肝組織相比,肝癌組織中myo6的表達(dá)顯著高于正常肝組織。2、干擾my06的表達(dá),抑制了肝癌的增殖能力。其機(jī)制可能涉及激活p38-mapk通路和降低pras40磷酸化水平共同作用抑制肝癌增殖,其中通過激活p38-mapk通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡和降低pras40磷酸化水平抑制細(xì)胞自噬可能起重要作用。2.1慢病毒(lv-myo6shrna-gfp)感染hepg2及smmc7721肝癌細(xì)胞(moi=10)的感染率均超過了80%,感染后my06mrna和蛋白的表達(dá)都有明顯下降。2.2mtt實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)及brdu摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果示:干擾myo6表達(dá)后明顯降低hepg2及smmc7721肝癌細(xì)胞增殖并抑制肝癌細(xì)胞dna合成。2.3流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)干擾myo6表達(dá)后hepg2肝癌細(xì)胞凋亡水平的變化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:凋亡明顯增加;采用westernbolt技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白,結(jié)果顯示:干擾myo6表達(dá)顯著上調(diào)自噬底物p62的表達(dá)水平,同時(shí)干擾myo6后lc3i向lc3ii轉(zhuǎn)化明顯減少,細(xì)胞免疫熒光得到類似結(jié)果,進(jìn)一步驗(yàn)證了干擾myo6表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞自噬水平;為了探討干擾myo6對(duì)肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響,我們?cè)趆epg2肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染myo6shrna四天后,通過流式細(xì)胞術(shù)分析hepg2細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。結(jié)果顯示:干擾myo6表達(dá)后g0/g1期和g2/m期的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)相應(yīng)增加,而s期細(xì)胞比例降低。2.4為了分析干擾my06的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖能力的機(jī)制,我們采用了細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路檢測(cè)試劑盒結(jié)合westernblot的檢測(cè)方法,發(fā)現(xiàn)在相關(guān)的信號(hào)通路中p38-mapk通路被激活,而pras40的磷酸化水平被抑制。據(jù)此,我們推測(cè)其機(jī)制可能涉及激活p38-mapk通路和降低pras40磷酸化水平共同作用抑制肝癌增殖,其中通過激活p38-MAPK通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡和降低PRAS40磷酸化水平抑制細(xì)胞自噬可能起重要作用。3、干擾MY06抑制肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,可能與抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。3.1我們采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究,結(jié)果顯示:干擾MYO6表達(dá)后細(xì)胞透膜數(shù)明顯減少,提示肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力下降3.2為了進(jìn)一步探討其機(jī)制,我們采用Western blot技術(shù)檢測(cè)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示:干擾MYO6表達(dá)后肝癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)明顯上調(diào),而Vimentin表達(dá)下調(diào)。說明干擾MYO6表達(dá)可能通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。結(jié)論:MYO6在肝癌組織中高表達(dá),干擾MYO6表達(dá)抑制了肝癌細(xì)胞增殖。其機(jī)制可以從肝癌細(xì)胞的凋亡、自噬和細(xì)胞周期變化三個(gè)方面考慮。其信號(hào)通路可能涉及通過激活p38-MAPK通路和下調(diào)PRAS40磷酸化水平抑制細(xì)胞增殖。其中,通過激活p38-MAPK通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡和降低PRAS40磷酸化水平抑制細(xì)胞自噬可能起重要作用。此外,我們研究發(fā)現(xiàn)干擾MYO6表達(dá)通過抑制肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。本研究結(jié)果通過體外實(shí)驗(yàn)闡述了MYO6在肝癌增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機(jī)制,需要進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究去證實(shí)MYO6的作用,以期為肝癌的基因靶向治療提供理論依據(jù)。
【圖文】：

圖 1 細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路檢測(cè)試劑盒抗體列陣4.2 蛋白電泳（Western blot）法①蛋白提取及樣品制備各種處理的細(xì)胞待孵育結(jié)束后細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，2000 rpm離心5 min收集細(xì)胞。預(yù)冷的 PBS 重懸洗滌細(xì)胞后 2000 rpm 離心 5 min，重復(fù)兩次后棄 PBS，根據(jù)沉淀細(xì)胞的量加入相應(yīng)體積的細(xì)胞裂解液，吹打混勻，冰浴 15 min 后用超聲波細(xì)胞破碎儀在冰浴中短暫多次超聲細(xì)胞，直至裂解液不粘稠。4 ℃ 12000 rpm離心 10 min，吸取上清。采用 BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定以上所提取蛋白的濃度，調(diào)整上樣量使各組蛋白終濃度一致，在樣品中按 4：1 加入 5 x 上樣緩沖液，100℃煮沸 5 min 使蛋白質(zhì)變性，樣品經(jīng)變性后可直接跑電泳或儲(chǔ)存于-80℃冰箱待用。② SDS-PAGE 凝膠電泳1) 將玻璃板洗凈后無水乙醇沖洗晾干，按長板對(duì)短板安裝于架子上；

圖 2 A 為 Transwell 遷移模型；B 為 Transwell 侵襲模型① Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)（如圖 2 A）：（1） HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒感染步驟同前。轉(zhuǎn)染前 HepG2 細(xì)胞分組情況如下：Control 組，Lv-shCon 組，Lv-shMYO6 組。（2） 從培養(yǎng)箱中取出 6 孔板，放入超凈工作臺(tái)，吸棄上清液，用 PBS 液清洗 2-3次，每孔加入 0.5ml 的 0.25%胰蛋白酶，靜置 1-2 min，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)逐漸變圓時(shí)，棄胰蛋白酶，分別加入 1ml 含 10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化，，然后用移液槍反復(fù)地輕輕吹打，使貼壁細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，移入1.5mlEp 管中，1500rpm×5min 離心，棄去培養(yǎng)液，加 1mL PBS 重懸，1500rpm×5min 離心后，去上清液，再用含 0.2%BSA 的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。（3） 細(xì)胞計(jì)數(shù)：用移液管將細(xì)胞重懸液輕輕吹打均勻，吸取細(xì)胞懸液滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2518964